Повреждения оснований ДНК химическими мутагенами

Азотистые основания в ДНК могут подвергаться разнообразным повреждениям: алкилированию, окислению, восстановлению или связыванию основания с формамидными группировками. Репарация начинается с присоединения ДНК-N-гликозилазы к повреждённому основанию. Существует множество ДНК-М-гликозилаз, специфичных к разным модифицированным основаниям. Ферменты гидролитически расщепляют N-гликозидную связь между изменённым основанием и дезоксирибозой, это приводит к образованию АП-сайта в цепи ДНК (первый этап). Репарация АП-сайта может происходить или только при участии ДНК-инсертазы, которая присоединяет к дезоксирибозе основание в соответствии с правилом комплементарности, или при участии всего комплекса ферментов, участвующих в репарации: АП-эндонуклеазы, АП-экзонуклеазы, ДНК-полимеразы β и ДНК-лигазы.

В. Дефекты репарационных систем и наследственные болезни

Репарация необходима для сохранения нативной структуры генетического материала на протяжении всей жизни организма. Снижение активности ферментов репарационных систем приводит к накоплению повреждений (мутаций) в ДНК.

Причиной многих наследственных болезней человека выступает нарушение отдельных этапов процесса репарации.

Пигментная ксеродерма

У больных в системе репарации снижена активность ферментов, ответственных за удаление неправильных оснований, "застройку" бреши и другие функции. Дефект репарационной системы проявляется в сверхчувствительности к УФ-свету, что приводит к появлению красных пятен на коже, переходящих в незаживающие коросты и нередко в рак кожи.

Трихотиодистрофия

Заболевание связано с повышенной фоточувствительностью ДНК, вызванной снижением активности фермента, участвующего в удалении димеров тимина. Симптомы заболевания: ломкость волос вследствие нехватки серы в белках волос и их луковиц; часто умственная д физическая отсталость; аномалии кожи и зубов.

Циклические АМФ и ГМФ как вторичные посредники. Активация протеинкиназ и фосфорилирование белков, ответственных за проявление гормонального эффекта.

Если сигнал воспринимается мембранными рецепторами, то схему передачи информации можно представить так:

· взаимодействие рецептора с сигнальной молекулой (первичным посредником);

· активация мембранного фермента, ответственного за образование вторичного посредника;

· образование вторичного посредника цАМФ, цГМФ, ИФ3, ДАТ или Са²⁺;

· активация посредниками специфических белков, в основном протеинкиназ, которые, в свою очередь, фосфорилируя ферменты, оказьюают влияние на активность внутриклеточных процессов.

Несмотря на огромное разнообразие сигнальных молекул, рецепторов и процессов, которые они регулируют, существует всего несколько механизмов трансмембранной передачи информации: с использованием аденилатциклазной системы, инозитолфосфатной системы, каталитических рецепторов, цитоплазматических или ядерных рецепторов.

Гуанилатциклаза катализирует образование цГМФ из ГТФ, одного из важных посредников внутриклеточной передачи сигнала (рис. 5-32, 5-33). Гуанилатциклаза находится в клетке, как в мембранносвязанном состоянии, так и в цитозольном.

Соотношения этих двух форм фермента в различных тканях разное. Например, в клетках тонкого

Рис. 5-32. Образование 3',5'-циклического ГМФ (цГМФ).

Рис. 5-33. Регуляция активности мембранной (1) и цитозольной (2) гуанилатциклазы.

кишечника 90% гуанилатциклазы находится в мембранах, а в лёгких и печени - лишь 20%. Цитозольная и мембранносвязанная гуанилатциклазы различаются не только по локализации, но и по молекулярной массе, активности, способу регуляции.

Цитозольная форма гуанилатциклазы состоит из двух субъединиц (α и β) и содержит в своём составе простетическую группу - гем. В области гема связывается активатор этой формы гуанилатциклазы - оксид азота (NO), образующийся из аргинина под действием фермента синтазы оксида азота (см. раздел 9).

Мембраннсювязанная гуанилатциклаза - трансмембранный гликопротеин. Внутриклеточный домен гуанилатциклазы проявляет каталитическую активность, внеклеточный домен служит рецептором. Присоединение активатора к рецептору вызывает изменение конформации в мембранном и цитозольном доменах и, как следствие, активацию гуашиатциклазы. В тканях человека присутствуют 3 типа мембранносвязанных гуанилатциклаз, в активации которых принимают участие специфические регуляторы - предсердный натрийуретический фактор (ПНФ), натрийурети-ческий пептид из мозга и кишечный пептид гуанилин.

В клетках тканей выявлены 3 основных типа внутриклеточных рецепторных белков, с которыми взаимодействует цГМФ: цГМФ-зависимая протеинкиназа (протеинкиназа G), цГМФ-регулируемые ионные каналы и цГМФ-регулируемая фосфодиэстераза, специфичная к цАМФ (катализирует превращение цАМФ в АМФ).

цГМФ играет важную роль в регуляции Са²⁺-гомеостаза в различных типах клеток. Повышение концентрации цГМФ приводит к понижению концентрации Са²⁺ как в результате активации Са²⁺-АТФ-аз, так и за счёт подавления

рецепторзависимого поступления этого иона в цитоплазму клетки. Эти эффекты опосредованы действием протеинкиназы G на мембранные белки, участвующие в обмене Са²⁺.

Аденилатциклаза

Фермент аденилатциклаза, катализирующий превращение АТФ в цАМФ (рис. 5-36), - ключевой фермент аденилатциклазной системы передачи сигнала. Аденилатциклаза обнаружена во всех типах клеток.

Фермент относят к группе интегральных белков клеточной мембраны, он имеет 12 трансмембранных доменов. Внеклеточные фрагменты аденилатциклазы гликозилированы. Цитоплазматические домены аденилатциклазы имеют два каталитических центра, ответственных за образование цАМФ - вторичного посредника, участвующего в регуляции активности фермента протеинкиназы А.

На активность аденилатциклазы оказывают влияние как внеклеточные, так и внутриклеточные регуляторы. Внеклеточные регуляторы (гормоны, эйкозаноиды, биогенные амины) осуществляют регуляцию через специфические рецепторы, которые с помощью α-субъединиц G-белков передают сигналы на аденилатциклазу. α_s-Субъединица (стимулирующая) при взаимодействии с аденилатциклазой активирует фермент, α-субъединица (ингибирующая) ингибирует фермент. В свою очередь, аденилатциклаза стимулирует проявление ГТФ-фосфатазной

Рис. 5-36. Образование циклического аденозинмонофосфата (цАМФ).

активности α-субъединиц. В результате дефосфорилирования ГТФ образуются субъединицы α_s-ГДФ и α_i-ГДФ, не комплементарные аденилатциклазе.

Из 8 изученных изоформ аденилатциклазы 4 - Са²⁺-зависимые (активируются Са²⁺). Регуляция аденилатциклазы внутриклеточным кальцием позволяет клетке интегрировать активность двух основных вторичных посредников цАМФ и Са²⁺.

Активация протеинкиназы А (ПКА)

· Молекулы цАМФ могут обратимо соединяться с регуляторными субъединицами ПКА.

· Присоединение цАМФ к регуляторным субъединицам (R) вызывает диссоциацию комплекса С₂R₂ на комплекс цАМФ₄ R₂ и С + С.

· Активная протеинкиназа А фосфорилирует специфические белки по серину и треонину, в результате изменяются конформация и активность фосфорилированных белков, а это приводит к изменению скорости и направления регулируемых ими процессов в клетке.

· Концентрация цАМФ.в клетке может регулироваться, она зависит от соотношения активностей ферментов аденилатциклазы и фосфодиэстеразы.

Большую роль в регуляции внутриклеточной сигнальной системы играет белок AKAP_s. "Заякоренный" белок AKAPs участвует в сборке ферментных комплексов, включающих не только

Рис. 5-41. Аденилатциклазная система.

протеинкиназу А, но и фосфодиэстеразу и фосфопротеинфосфатазу.

Каскадный механизм усиления и подавления сигнала.Передача сигнала от мембранного рецептора через G-белок на фермент аденилатциклазу служит примером каскадной системы усиления этого сигнала. Одна молекула, активирующая рецептор, может "включать" несколько G-белков, и затем каждый активирует несколько молекул аденилатциклазы с образованием тысяч молекул цАМФ. На этом этапе сигнал усиливается в 10²-10³ раз. Образующийся цАМФ "включают" другой фермент - протеинкиназу А, усиливая сигнал ещё в 1000 раз. Фосфорилирование ферментов протеинкиназой А ещё больше усиливает сигнал, в результате суммарное усиление равно 10⁶-10⁷ раз. Таким образом, по механизму каскадного усиления одна молекула регулятораспособна изменить активность миллионов других молекул.

Но для любой из систем трансмембранной передачи сигнала клетка имеет другую еистему, подавляющую этот сигнал. Каждый из этапов в ферментном каскаде находится под контролем специальных подавляющих этот сигнал механизмов. Например, длительное действие гормона приводит к десенсибилизации мембранных рецепторов: они либо инактивируются, либо вместе с гормоном погружаются в клетку посредством эндоцитоза. В результате десенсибилизации рецепторов степень активации аденилатциклазной системы снижается. Если в клетке длительное время повышена концентрация цАМФ (повышена активность протеинкиназы А), может происходить фосфорилирование кальциевых каналов, что приводит к повышению концентрации Са²⁺ в клетке. Кальций активирует Са²⁺-зависимую фосфодиэстеразу, катализирующую превращение цАМФ в АМФ. В результате инактивации протеинкиназы А (R₂C₂) снижается скорость фосфорилирования специфических ферментов. Завершает "выключение" системы фосфопротеинфосфатаза, дефосфорилирующая фосфопротеины.

Б.25

1. Методы фракционирования белков: осаждение солями и органическими растворителями, гель-фильтрация, электрофорез, ионообменная и аффинная хроматографии. Принципы, лежащие в основе фракционирования. Методы количественного определения белка.

Индивидуальные белки различаются по своим физико-химическим свойствам: форме молекул, молекулярной массе, суммарному заряду молекулы, соотношению полярных и неполярных групп на поверхности нативной молекулы белка, растворимости белков, а также степени устойчивости к воздействию денатурирующих агентов.

Получение индивидуальных белков из биологического материала (тканей, органов, клеточных культур) требует проведения последовательных операций, включающих:

-дробление биологического материала и разрушение клеточных мембран;

-фракционирование органелл, содержащих те или иные белки;

-экстракцию белков (перевод их в растворённое состояние);

-разделение смеси белков на индивидуальные белки.

Метод очистки белков, основанный на различиях в их растворимости при разной концентрации соли в растворе. Соли щелочных и щёлочно-земельных металлов вызывают обратимое осаждение белков, т.е. после их удаления белки вновь приобретают способность растворяться, сохраняя при этом свои нативные свойства.

Чаще всего для разделения белков методом высаливания используют разные концентрации солей сульфата аммония - (NH₄)₂SO₄. Чем выше растворимость белка, тем большая концентрация соли необходима для его высаливания.