Влияние рН среды на активность амилазы слюны
Содержимое каждой пробирки после прибавления слюны тщательно перемешивают и оставляют при комнатной температуре (20оС) на 15—20 мин. Через 10 мин. берут пробы из третьей пробирки, переносят на стеклышко и проделывают реакцию с каплями раствора Люголя. Вначале обычно получается синее окрашивание, затем фиолетовое, фиолетово-красное, красно-бурое, желтое. Как только содержимое третьей пробирки будет давать желтое окрашивание, через 1—2 минуты приливают во все пробирки по 1 капле раствора Люголя.
На основании полученной окраски судят о степени расщепления крахмала в зависимости от рН среды.
Схема записи протокола опыта
| № пробирки | рН буферного раствора | Объем растворов для получения буферного раствора с заданным рН | Субстрат (крахмал) 0,5% | Фермент амилаза | Результат опыта с раствором Люголя (рисунок пробирки с полученным цветом раствора) | |
| 1/15М дигидрофосфата калия | 1/15М гидрофосфата натрия | |||||
| 5,6 | 0,25 | 4,75 | ||||
| 6,2 | ||||||
| 7,4 | ||||||
| 4,75 | 0,25 |
Специфичность ферментов
Принцип работы: каждый фермент может катализировать только одну реакцию, действуя на одно вещество или ряд близко родственных веществ. Высокая специфичность - одно из наиболее характерных свойств ферментов. Амилаза слюны ускоряет гидролиз только полисахаридов и не оказывает никакого действия на дисахариды. В случае расщепления сахарозы на глюкозу и фруктозу реакция Троммера должна быть положительной. При расщеплении крахмала до глюкозы эта проба также положительна.
1. Работа проводится с 2 пробирками по следующей схеме:
| Реактивы | № пробирки | Результаты опытов по реакции (рисунок пробирки с полученным цветом раствора) | ||
| с раствором Люголя | с раствором Троммера | |||
| Крахмал | 2 мл | - | ||
| Сахароза (1% раствор) | - | 2 мл | ||
| Амилаза | 0,5 мл | 0,5 мл |
2. Далее пробирки ставят на 10 минут в термостат при температуре 38оС.
3. После термостатирования с содержимым пробирок проделывают реакции с йодом на присутствие крахмала и пробу Троммера на присутствие глюкозы:
1 мл исследуемого раствора + 0,5 мл 10% раствора гидроксида натрия + 5 капель 1% раствора сульфата меди.
Пробирку нагревают в кипящей водяной бане. При наличии глюкозы появляется желтое окрашивание, переходящее в красное.
Влияние активаторов и ингибиторов на активность ферментов
В данной работе исследуется влияние на каталитическую активность амилазы слюны хлорида натрия и сульфата меди.
Нумеруются три пробирки. В пробирку №1 наливают 1 мл воды; в пробирку № 2 - 0,8 мл воды и 0,2 мл. 1% раствора хлорида натрия, в пробирку № 3 - 0,8 мл воды и 0,2 мл 1% раствора сульфата меди.
Во все пробирки добавляют по 1 мл разведенной слюны и по 1 мл 0,5% крахмала и оставляют на 3 мин. при комнатной температуре. Затем проверяют действие ферментов в пробирке №2, где предполагается наибольшая активность амилазы. Для этого из пробирки №2 отбирают несколько капель и проделывают пробную реакцию с йодом; эту реакцию повторяют каждые 20—30 секунд, пока не получат оранжевое или желтое окрашивание. Затем добавляют йод в пробирки № 1, 2, 3. Отмечают окрашивание и записывают результаты в виде таблицы.
Схема записи протокола опыта
| № пробирки | Объем воды, мл | Модулятор | Фермент амилаза, мл | Субстрат (крахмал 0,5%), мл | Результат опыта по реакции с йодом (рисунок пробирки с полученным цветом раствора) |
| - | |||||
| 0,8 | 0,2 мл хлорида натрия | ||||
| 0,8 | 0,2 мл сульфата меди |
Часть 2. Исследование химического состава слюны
Обнаружение анионов неорганических кислот
1. Ополоснув рот водой, собирают около 1 мл слюны в пробирку или флакончик и разводят тройным количеством дистиллированной или кипяченой воды. Отливают половину содержимого в другую пробирку и капают примерно десять капель раствора ляписа - нитрата серебра АgNОз (можно растворить в 1 мл воды половину ляписного карандаша из аптеки; примеси не помешают опыту).
2. К белому осадку, выпавшему в пробирке, добавляют конц. уксусную кислоту, и осадок частично растворится. Так при взаимодействии с нитратом серебра ведут себя соли соляной и фосфорной кислот - хлориды и фосфаты.
3. Вторую часть раствора слюны слегка подкисляют слабым раствором соляной кислоты и добавляют несколько капель 3%-ного раствора хлорида железа (III) FeСl3. Красно-бурая окраска свидетельствует о том, что в растворе есть роданиды - соли роданистоводородной (HCNS) кислоты. В то время как в слюне у курильщиков мало амилазы, роданидов, напротив, больше обычного.