Изменения в составе ферментов
Процессы, близкие к проращиванию, происходят в любом зерне в начале образования из него растения. Начинают развиваться зачаточные органы зародыша - зародышевый листок и зародышевые корешки.
Во время замочки зерно получает необходимое количество воды, что способствует развитию основных биологических процессов обмену веществ с его диссимиляцией и ассимиляцией.
В зародыше и близлежащей к нему области зерна находится сравнительно небольшой запас веществ (сахаров, аминокислот и полипептидов, а также минеральных соединений и пр.), которые могут быть растворены в поступившей воде и обеспечить на первое время питание зародыша. Но для протекания дальнейших процессов питания и роста зерна требуется постоянное пополнение этого запаса, т. е. подвод новых количеств низкомолекулярных соединений. Вода усиливает гидратацию, способствуя этим процессам гидролиза высокомолекулярных соединений, осуществляемым в основном ферментами.
Первые признаки жизни проявляются в щитке и сопровождаются накоплениями в нем гормоноподобных веществ, диффундирующих в алейроновый слой для образования там ферментов. Материалом для образования ферментов служат те аминокислоты, которые выделяет эндогенно гибберелловая кислота.
В щитке ячменя, как и других злаков, уже имеется небольшое количество гормоноподобных веществ, содержащих гибберелловую кислоту, дальнейший синтез которых при проращивании зерна приводит к накоплению их в значительных количествах. Из щитка эти вещества во время ращения зерна диффундируют в прилегающие клетки алейронового слоя и дают толчок к синтезу ряда гидролизующих ферментов (α-амилазы, протеолитических ферментов, эндо-β-глюконазы), которые разрушают стенки клеток эндосперма. Особое значение имеет действие протеаз, так как они проявляют гидролитическое действие на белковые вещества, которыми покрыты крахмальные зерна, и гемицеллюлозные структуры.
Пальмер считает, что превращение твердого ячменя в рыхлый солод зависит прежде всего от разрушающего действия протеаз.
Еще в 1960 г. Поллок указывал на вещество, которое было выделено из замочной воды и зеленого солода путем адсорбции активированным углем и элюирования ацетоном. Оно и оказывало на прорастаемость ячменя, находящегося еще в состоянии послеуборочного дозревания, такое же действие, как гибберелловая кислота.
Йомо (по работе Бриггса) показал, что при совместном культивировании изолированных зародыша и эндосперма (с его алейроновым слоем) амилазная активность их выше, чем в том случае, когда эти изолированные части ячменного зерна культивируются отдельно. Таким образом, эндосперм вместе с алейроновым слоем являются местом накопления ферментов, а зародыш продуцирует вещество, которое способствует выделению α-амилазы. Это вещество, названное растительным гормоном AFX, действует подобно гибберелловой кислоте и имеет кислотный характер. С другой стороны, если ячменное зерно, у которого отделен зародыш, обрабатывать гибберелловой кислотой, оно выделяет ряд ферментов и подвергается полному растворению. Анна Мак Леод считает, что главную роль в указанном процессе играет именно алейроновый слой. Подвергаясь действию гибберелловой кислоты, он ускоряет продуцирование ферментов. Установлено, что удаление из незамеченного ячменного зерна алейронового слоя не позволяет этому зерну, помещенному в нормальные условия замочки, продуцировать ферменты (в том числе и эндо-β-глюканазу), действующие на растворение стенок клеток эндосперма. Если же на обработанное указанным образом зерно действовать гибберелловой кислотой, то способность растворения стенок клеток эндосперма восстанавливается. Вещество, которое выделяется зародышем и действует на слой алейроновых клеток, Мак-Леод назвала зародышевым фактором (Embryo factor). Отсюда можно сделать вывод, что, с одной стороны, алейроновый слой является источником образования новых ферментов, а с другой - и местом приложения действия гибереллина. Установлено, что 1 кг ячменя содержит 2-3 γ веществ типа гиббереллина A3.
Для проявления активности гиббереллинов и синтезированных ими ферментов необходимы определенные условия внешней среды, основными из которых являются влажность, определенная температура и соответствующая концентрация водородных ионов. Однако создавшиеся в зерне условия не являются благоприятными для всех ферментов; только сравнительно небольшая часть их при проращивании находится в оптимальных или близких к ним условиях активности. К этому следует добавить, что зародышу для его существования требуется кислород, наличие которого для действия ферментов необходимо.
Установлено, что медленное холодное проращивание зерна наиболее желательно для приготовления солода хорошей растворимости, с большой ферментативной активностью. Критической температурой является температура, при которой накопление цитолитических, амилолитических, протеолитических и других ферментов происходит наиболее благоприятно. Для ячменя нормальных кондиций такой температурой является 17° С, превышение этой температуры хотя и вызывает усиление роста стебелька и ростков, но сопровождается ослаблением наращивания ферментативной активности и худшим растворением эндосперма.
Фактор времени тоже имеет значение в превращении веществ зерна; чем продолжительнее действие ферментов, тем больше образуется гидролизованных веществ.
Важным обстоятельством для нормального процесса солодоращения является сохранение в зерне необходимой влажности (42-43%). Вода в зерне выполняет роль дисперсионной среды, в которой не только происходит действие ферментов, но и накапливаются и соответствующим образом распределяются продукты ферментативного гидролиза.
Добавочное опрыскивание подсушенного зерна в роще не компенсирует полностью недостатка влаги внутри зерна; для проникновения ее в зерно требуется время, а колебания влажности вызывают колебания в нормальном действии ферментов.
Ферменты, участвующие в процессе солодоращения. Распад углеводов катализируется гидролитическими ферментами, называемыми карбогидразами. Действие этих ферментов заключается в разрыве эфирных, связей -С-О-С-, которые служат для соединения двух молекул более простых сахаридов. Путем присоединения молекулы воды происходит распад более сложных сахаридов на более простые, например дисахарид мальтоза распадается на две молекулы моносахарида глюкозы:
В процессе солодоращения из карбогидраз особое значение имеют три группы ферментов: цитолитические ферменты, разлагающие гемицеллюлозу и другие некрахмалистые полисахариды, амилолитические, расщепляющие крахмал, и протеолитические.
В образовании гидролитических ферментов основная роль принадлежит ростовым веществам - гибберелловой кислоте. После гидратации алейронового слоя эта кислота начинает проявлять свою активность и синтезировать α-амилазу и протеазу. Протеаза нужна для высвобождения β-амилазы из связанного состояния.
Цитолитическая группа ферментов. В процессе растворения зерна, т. е. перехода твердого состояния мучнистого тела в рыхлое, когда эндосперм легко может быть растерт между пальцами, значительную роль играют цитолитические ферментные системы. В пивоварении широкое распространение получил термин «цитаза», под которым подразумевается комплекс ферментов, участвующих в процессе разрыхления структуры зерна, которому присвоено название цитолиза. Этот комплекс ферментов состоит из гемицеллюлазы, целлюлазы, глюконазы, ксиланазы, пектиназы и т. п. Объектом воздействия этих ферментов являются вещества стенок клеток эндосперма - гемицеллюлоза и пентозаны (ксилан, арабан, арабаноксилан), а также гумми-вещества.
Установлено, что активность целлюлазы постепенно возрастает вплоть до 7-го дня ращения ячменя, а активность гемицеллюлазы наиболее сильно увеличивается между 5-м и 7-м днями ращения.
В результате действия гемицеллюлазы стенки клеток эндосперма растворяются и делаются проницаемыми для ферментов. Гексозы и пентозы, получаемые в результате ферментативного гидролиза, расходуется на построение новых тканей.
Люерс изучал действие цитолитических ферментов и установил, что оптимальными для них являются температура 45° С и pH 5,0. Активность цитолитического комплекса в процессе солодоращения значительно увеличивается.
Наиболее благоприятное действие этот комплекс может оказать при затирании солода при низких температурах, если сохранить его активность при сушке.
Дальнейшие работы, проведенные Присом по изучению процесса цитолиза, показали, что имеются две группы ферментов, атакующих гемицеллюлозу и растворимые гумми-вещества.
Одна группа катализирует расщепление глюкозидных связей внутри большой молекулы вещества. Она получила название эндополиглюкозидазы (эндо-β-глюканаза). Другая .группа отщепляет концевые остатки сахаров. Ей присвоено название экзополиглюкозидазы (экзо-β-глюканазы). Эндополиглюкозидазы оказывают цитокластическое действие и дают в результате высокомолекулярные продукты распада, а экзополиглюкозидазы обладают цитолитическим действием и ведут при гидролизе к накоплению сахаров и полиоз с увеличенным количеством редуцирующих групп. Первые резко уменьшают величину молекул и быстро понижают вязкость растворов. Во время солодоращения происходит значительное увеличение активности эндо-β-глюканазы, что для процессов пивоварения в целом имеет большое значение.
В своих работах Прис уделяет много внимания β-глюкану, являющемуся главной составной частью гемицеллюлоз ячменя. β-Глюкан выделен в чистом виде путем осаждения его из раствора 20%-ным раствором сернокислого аммония.
Установлено, что расщепление β-глюкана осуществляется специальным ферментом эндо-β-глюканазой, которая состоит из трех фракций: AI, AII, AIII, обладающих различным оптимумом pH и различным отношением к температуре: например, AI теряет половину своей активности при нагревании этой фракции при температуре 40° С в течение 0,7 ч, а фракция АIII при той же температуре - в течение 5,2 ч. Оптимум pH первой фракции 4,75, а второй 4,55.
Эндо-β-глюканаза действует на β-1,3-и β-1,4-связи β-глюкана, причем превалирует разрыв β-1,3-связей.
Экзо-β-глюканаза преимущественно разрывает β-1,4-связи и является причиной освобождения редуцирующих групп из β-глюкановой цепи. На связи 1,3 она или вовсе не действует, или действие происходит в незначительной степени. В этом отношении можно отметить аналогию с действием β-амилазы на цепи амилозы.
Дальнейшее действие на олигосахариды, получаемые в результате указанного распада, осуществляется олигосахаразой.
Таким образом, во время солодоращения распад β-глюкана протекает по схеме: β-глюкан→β-глюкановые декстрины (с пониженной вязкостью)→различные олигосахариды, включая целлобиозу; дальнейший ферментативный распад целлобиозы может дать глюкозу.
Меньшую группу представляют пентозаны (арабаноксиланы), в превращениях которых, по Прису, принимают участие четыре фермента. Арабанозидаза освобождает боковые цепи высокомолекулярного арабаноксилана, причем образуются олигосахаридные продукты.
Эндоксиланаза расщепляет длинные цепи арабаноксилана с минимальным образованием редуцирующих групп; получаются продукты типа декстринов, имеющие боковые цепи, препятствующие атакам арабанозидазы; отщепление этих цепей осуществляется экзоксиланазой. Наконец, имеется фермент, который расщепляет получающиеся олигосахариды до ксилана; он носит название ксилобиазы (или ксило-олигосахаразы).
Во время соложения эндоактивность становится несравнимо сильнее, чем экзоактивность, и высушенный солод практически лишен экзоферментов.
Фракционирование ячменных и солодовых гумми-веществ путем осаждения сернокислым аммонием показало, что фракции, содержащие глюкозаны, исчезают во время соложения.
Амилолитические ферменты. Амилазы действуют на высокомолекулярные полисахариды-крахмал и гликоген. В растительных амилазах различают α- и β-амилазы, которые могут встречаться в растительных объектах вместе или отдельно.
Механизм их действия различен; β-амилаза в результате своего действия превращает всю молекулу амилозы в мальтозу, а молекулу амилопектина - только на 54%, причем оставшаяся часть молекулы дальше гидролизуется α-амилазой до неокрашивающихся йодом декстринов; часть этих декстринов делается теперь доступной осахариванию β-амилазой. Таким образом, процесс осахаривания крахмала является результатом совместного действия обеих амилаз.
Ряд амилаз получен в кристаллическом виде, в частности солодовая амилаза, и точно установлена их химическая природа. Амилазы встречаются во всех растительных объектах - высших растениях, плесневых грибах и бактериях.
В солодовой амилазе различают три основные функции: разжижающая, декстринирующая и осахаривающая; из них разжижение крахмального клейстера зависит исключительно от действия α-амилазы, которую можно рассматривать как эндоамилазу, так как она может расщеплять глюкозидные связи в середине полисахаридных цепей. Осахаривание зависит в большой степени от действия β-амилазы, которая является экзоамилазой, действующей на нередуцирующие концы цепи полисахаридов, последовательно отщепляя остатки мальтозы. Однако небольшая роль в этом процессе должна быть отведена и α-амилазе. Образование же декстринов зависит как от действия α-амилазы, так и β-амилазы.
Основным технологическим этапом, где полностью проявляется действие как α-, так и β-амилаз, является затирание. Во время солодоращения происходит главным образом возрастание активности этих ферментов.
Наличие α-амилазной активности в покоящемся ячменном зерне можно обнаружить после длительного периода хранения зерна и то только в очень небольших количествах.
При нормальных условиях солодоращения накопление α-амилазы довольно резко повышается до 4-го дня ращения зерна, а затем содержание α-амилазы увеличивается равномернее (рис. 18, а).
β-амилаза во все время ращения увеличивается довольно равномерно, без резких скачков (рис. 18, б).
Как показывают кривые, для накопления α-амилазы в достаточных количествах требуется полный цикл солодоращения, в то время как β-амилаза в основном накапливается в течение первых 4 (до 6) сут.
Действие α-амилазы в основном сводится к некоторой обработке крахмальных зерен эндосперма и подготовке их к более легкому осахариванию в дальнейшем технологическом процессе.
Микроскопическое исследование крахмальных зерен после солодоращения показывает, что они становятся изъеденными вследствие обработки их α-амилазой.
В готовом солоде, по Бриггсу, 7% всего количества α-амилазы находится в зародыше, остальные 93% -в эндосперме.
Изобарт установил, что амилолитические ферменты чувствительны к снижению кислорода в среде, особенно α-амилаза.
Величина амилолитической активности зависит от размера зерен ячменя и содержания в них белка. Небольшие зерна с высоким содержанием белка дают солод с более высокой диастатической силой. Многие авторы связывают амилолитическую активность солода с содержанием белка в ячмене. Ниже приведены данные, характеризующие соотношение белка и ДС солода.
| Содержание белка в ячмене, % | ДС готового солода, условные единицы (около) |
Протеолитические ферменты. В ячмене существуют две группы протеолитических ферментов: протеиназы и пептидазы. Каждая группа, по-видимому, состоит из большого числа отдельных ферментов.
Они наряду с цитолитическими ферментами принимают участие в разрушении стенок клеток эндосперма.
Из протеиназ, действующих в растительных организмах, наиболее изученным является папаин, найденный в млечном соке дынного дерева. Характерной особенностью папаина, как и многих других растительных протеиназ, является активирование его синильной кислотой и соединениями, содержащими сульфгидрильную группу (-SH); среди них особенное значение имеет глютатион. Благодаря такому активированию неактивная окисленная форма папаина превращается в восстановленную форму, которая делается активной. В связи с этим считается, что в папаине существует равновесная система, состоящая из восстановленной и окисленной форм:
Папаин получен в кристаллическом виде. Молекулярная масса его равна 27 000.
Активность протеиназ при проращивании зерна резко повышается, это обусловлено накоплением в зародыше значительного количества глютатиона.
Глютатион, открытый английским биохимиком Гопкинсом в 1921 г., представляет собой трипептид, состоящий из остатков трех аминокислот: гликокола, цистеина и глютаминовой кислоты:
Глютатион благодаря наличию сульфгидрильной группы -SH обладает сильными восстанавливающими свойствами. Подобно цистеину две молекулы глютатиона, отдавая два атома водорода, соединяются одна с другой при помощи дисульфидной связи (-S-S-), при этом восстановленная форма глютатиона превращается в окисленную, состоящую из двух молекул. Эта реакция обратима, и глютатион причисляется к веществам окислительно-восстановительного характера.
Все живые клетки содержат глютатион. В начале проращивания ячменя значительно увеличивается количество глютатиона, причем более энергично в зародыше, чем в эндосперме. Например, за одни сутки в зародыше было отмечено увеличение количества глютатиона в пять раз, а в эндосперме только в два раза. В последующие дни проращивания зерна этот процесс в зародыше протекал не так энергично, но все-таки в итоге в зародыше содержалось больше глютатиона, чем в эндосперме.
В ячменном зерне содержатся протеиназы, максимальная активность которых, по Г. П. Карпиленко, проявляется при pH 3,8; 6,3 и 8,6; отсюда и деление протеиназ на кислые, нейтральные и щелочные.
Наибольшей активностью обладают кислые протеиназы ячменя, которые активируются цистеином по такой же схеме, как папаин глютатионом. Температурный оптимум (уже в солоде при его затирании) лежит при 60° С (54-72° С), но действует он и при солодоращении, причем, как показал Карпиленко, активность кислой протеиназы повышается в 15,5 раза во время прорастания в течение 3 сут.
Специфичность этой протеиназы низкая: белки переходят из нерастворимого состояния в растворимое н гидролизуются до аминокислот и низкомолекулярных пептидов.
Пептидазы делятся на три группы: аминопептидазы, карбоксипептидазы и дипептидазы.
Ферменты первых групп действуют на концевые аминные и карбоксильные связи в белках и пептидах. Ферменты третьей группы разлагают дипептиды. Все пептидазы обладают большой специфичностью.
Особенностью карбоксипептидазы является способность отщеплять остатки не только кислых и нейтральных аминокислот, но и основных, а также остатки пролина.
Большую роль в работе протеолитических ферментов играют естественные ингибиторы белковой природы, которые образуют с ферментами стойкие соединения и лишают их каталитической активности. В процессе солодоращения, по-видимому, происходит снижение активности ингибиторов.
При проращивании ячменя уже в замоченном ячмене можно отметить повышение протеиназной активности. Она предшествует проявлению амилолитической активности. Амилолитическая активность при замочке уменьшается и затем при проращивании ячменя постепенно нарастает до определенного максимума, за которым следует постепенная убыль. Максимальная активность протеолитических ферментов, как протеиназ, так и пептидаз, с некоторыми колебаниями выявляется на 5-е сутки проращивания ячменя. Пептидазная активность выявляется позже протеиназной. Это подтверждается наблюдениями Вальдшмидт-Лейтца, результаты работы которого приведены в табл. 37.
Таблица 37
| Стадии соложения ячменя | Активность, условные единицы | |||
| амилазы | протеиназы | полипептидазы | дипептидазы | |
| Ячмень | - | |||
| непророщенный | ||||
| замоченный | ||||
| наклюнувшийся | ||||
| Длина ростков, см | ||||
Бишоп показал, что накопление продуктов распада белков (среди которых фракция аминокислот и пептидов является наиболее важной) происходит в первой фазе (4-5 дней) главным образом за счет гордеина, количество которого заметно уменьшается. Глютелиновая фракция участвует в этом процессе в меньшей степени. Изменения количества альбумина и глобулина по сравнению с фракциями белка, указанными выше, небольшие.
Аминокислоты, образовавшиеся при гидролитическом расщеплении белков, подвергаются под каталитическим действием амидаз в растительном организме дальнейшей диссимиляции, важнейшим этапом которой является дезаминирование; образуются кетокислоты и аммиак. Эта реакция является очень важной в процессе превращения азотсодержащих веществ в безазотистые соединения; благодаря дезаминированию осуществляется переход белковых веществ в углеводы и жиры.
Образующийся аммиак в высоких концентрациях является ядом для живых клеток и тканей растений, поэтому он должен быть удален или обезврежен; растения чрезвычайно быстро связывают его. В одних случаях, когда растение обладает большим содержанием углеводов, аммиак потребляется на образование других органических азотистых соединений путем прямого аминирования кетокислот, образовавшихся из углеводов. В других случаях, когда в растениях содержится большое количество органических кислот (яблочной, щавелевой и др.) аммиак может связываться с этими кислотами.
Чаще всего токсическое действие аммиака обезвреживается путем связывания его с аспарагиновой и глютаминовой кислотами. При этом образуются амиды - аспарагин и глютамин, которые являются безвредными для растения.
Наличие этих важных для жизни растений соединений установлено благодаря работам Д. Н. Прянишникова.
Аспарагин и глютамин имеют большое значение как материал для образования дикарбоновых кислот, необходимых для осуществления реакции переаминирования, имеющей важное значение для синтеза и превращения аминокислот в растительном организме и заключающейся в межмолекулярном переносе аминогруппы с аминокислоты на кетокислоту под действием ферментов - аминотрансфераз. Эта реакция переаминирования, открытая советскими биохимиками А. Е. Браунштейном и М. Г. Крицман, играет большую роль в процессе азотистого обмена клеток. Схематически она может быть изображена следующим уравнением:
Высокое содержание аспарагиновой и глютаминовой кислот в составе белков растительных клеток свидетельствует об исключительно важном значении этих аминокислот; существенную роль эти аминокислоты играют при проращивании зерна.
Амины, образующиеся в результате декарбоксилирования, могут подвергаться дальнейшим преобразованиям, в частности окислению и метилированию. В первом случае отщепляется аммиак и образуется соответствующий альдегид. Некоторые альдегиды используются на получение алкалоидов - физиологически очень активных веществ. Ho алкалоиды могут образовываться и путем метилирования аминов под каталитическим действием ферментов, называемых метилтрансферазами. Таким образом например, образуется содержащийся в ячменных ростках алкалоид горденин. Образование горденина происходит через тирамин, получающийся из тирозина при его декарбоксилировании.
Все злаки, а также солод этих злаков, хмель, виноград и пр. содержат холин, входящий в состав некоторых фосфатидов, в частности лецитина. При гидролизе лецитина образуется холин, он может образовываться также и путем метилирования из серина через полученный из него амин.
Широко распространенные в растительном мире, в частности в ячмене, и солоде, бетаины образуются путем метилирования не аминов, являющихся продуктами ассимиляции аминокислот, а непосредственно из самих аминокислот, например, гликокола.
Фосфатазы. Фосфатазы принадлежат к группе эстераз. Имеется несколько фосфорных эстераз, которые катализируют разложение эфиров фосфорной кислоты только с органическими соединениями с освобождением неорганического фосфора. Наиболее важной фосфатазой в солоде является фитаза, которая гидролизует фитин до неорганических фосфатов. Этот фермент сначала отщепляет от фитина инозитфосфорную кислоту, а затем расщепляет эту последнюю на инозит- и свободную фосфорную кислоту.
К фосфатазам следует отнести и нуклеотидазу, которая отщепляет в нуклеиновых кислотах фосфорную кислоту от углевода.
Оптимум действия фосфатаз лежит при разных значениях pH; часть из них действует в щелочной среде, но для большинства фосфатаз оптимумом является pH в пределах 5-6; оптимум действия фитазы при температуре 48° С лежит при pH 5,2.
Во время солодоращения активность всех фосфатаз значительно повышается, что имеет свое выражение в изменении состава фосфорсодержащих соединений.
Фосфатазная активность (по Крауссу) накапливается тем сильнее, чем ниже температура, при которой ведется процесс солодоращения (табл. 38).
| Фосфатазы | Содержание в солоде при различных режимах солодоращения, условные единицы | ||
| холодный | нормальный | теплый | |
| Фитаза | 26,3 | 16,0 | 14,2 |
| Нуклеотидаза | 16,4 | 14,6 | 14,1 |