Методические обеспечения протеомных исследований
Методы протеомных исследования:
1) Двумерный электрофарез (разделение белков по заряду и массе);
2) ВЭЖХ (высокоэффективная жидкостная хроматография);
3) ЯМР (ядерный магнитный резонанс);
4) Элетронный парамагнитный резонанс (резонансное поглощениие электромагнитного излучения неспаренными электронами);
5) Рентгеноструктурный анализ;
6) Масс-спектрометрия: MALDI,ESI; !!!(самый популярный)!!!
7) Флуоресцентная спектроскопия;
8) Фосфоресцентная спектроскопия (фосфоресценция – энергия, поглощенная веществом, высвобождается в виде света).
1) Двумерный электрофорез – метод разделения смеси белков, основанный на последовательном использовании двух свойств белков: заряда и массы. Во время проведения первого направления (еще называемого изоэлектрофокусированием, IEF) разделение белков основано на таком их свойстве, как изоэлектрическая точка (pI – isoelectric point). Изоэлектрическая точка определяется аминокисотным составом белка, и меняется при посттрансляционных модификациях. Когда белок попадает в гель с градиентом pH, к которому приложено электрическое поле, он начинает двигаться к электроду с противоположным зарядом: положительно заряженные белки перемещаются к катоду (отрицательно заряженный электрод), а отрицательно заряженные к аноду (положительно заряженный электрод). Во время миграции белок присоединяет или теряет протоны, в результате чего его заряд и подвижность снижается, и становится нулевой при достижении точки в градиенте pH, равной его pI. В этой точке он считается «сфокусированным», а на геле он выглядит как четко очерченное пятно. С помощью 2DE возможно разделить белки с очень близкими pI. Далее гель, полученный в ходе изоэлектрофокусирования кладут горизонтально на вершину полимеризованного между двумя стеклами геля, и начинается второе направление, в ходе которого разделение основано на массе белков (см. рис. 1). В результате белки представлены на электрофореграмме в виде пятен, идентификация конкретных белков проводится с помощью масс-спектрометрии.
Рис. 1. Схематическое представление хода двумерного электрофореза.
Анализ гелей, полученных в результате 2DE, более сложный по сравнению с анализом гелей, полученных в ходе 1DE из-за большего количества выделенных белков. Но это же является и значительным преимуществом 2DE по сравнению с одномерным электрофорезом: одновременно можно анализировать несколько белков, которые совместно экспрессируются в ходе изучаемого биологического процесса.
2) Высокоэффективная жидкостная хроматография — метод разделения сложных смесей веществ, основой хроматографического разделения является участие компонентов разделяемой смеси в сложной системе Ван-дер-Ваальсовых взаимодействий (преимущественно межмолекулярных) на границе раздела фаз. Принцип жидкостной хроматографии состоит в разделении компонентов смеси, основанном на различии в равновесном распределении их между двумя несмешивающимися фазами, одна из которых неподвижна, а другая подвижна (элюент). Отличительной особенностью ВЭЖХ является использование высокого давления (до 400 бар) и мелкозернистых сорбентов (обычно 3—5 мкм, сейчас до 1,8 мкм). Это позволяет разделять сложные смеси веществ быстро и полно (среднее время анализа от 3 до 30 мин).
3) ЯМР (ядерный магнитный резонанс) – резонансное поглощение электромагнитной энергии веществом, содержащим ядра с ненулевым спином во внешнем магнитном поле, обусловленное переориентацией магнитных моментов ядер. Одни и те же ядра атомов в различных окружениях в молекуле показывают различные сигналы ЯМР. Отличие такого сигнала ЯМР от сигнала стандартного вещества позволяет определить так называемый химический сдвиг, который обусловлен химическим строением изучаемого вещества.
5) Метод рентгеноструктурного анализа кристаллов органических веществ является очень плодотворным методом изучения геометрического строения молекул (взаимного расположения центров атомов и углов между связями). Он основан на том, что всякое вещество обладает способностью рассеивать падающее на него излучение, в том числе рентгеновское. При этом рассеяние рентгеновских лучей кристаллами находится в определенном соответствии с расположением атомов в кристалле. Особенностью метода – помогает выяснить не только очередность связи атомов друг с другом, но и их пространственное расположение, а также некоторые тонкости строения, трудно устанавливаемые иными путями. Так, рентгеноструктурный анализ является одним из главных способов определения наиболее выгодной конформации молекулы.
6) Масс-спектрометрия – метод исследования вещества, основанный на определении отношения массы к заряду ионов, образующихся при ионизации. Масс-спектрометрия устанавливает какие атомы входят в состав молекулы, какова структура их расположения и изотопный состав, а также какова масса молекулы.
МАЛДИ (матричная лазерная десорбционная ионизация), позволяет определять молекулярную массу и эмпирическую формулу соединения, а также некоторые его структурные особенности. Разработан в 1987 году.Технология:
- Готовят пробу: путем смешения исследуемого вещества (белковый образец) с матрицей (любой донор протонов, например НАДФН).
- Смесь подвергается действию УФ-лазера нана секундной длительностью, после чего происходит испарение матрицы и ионизация белков, и пептидов находящихся в образце.
- ионизирующие частицы в ионизированном состоянии влетают в особую конструкцию TOF, где ионизируемые частицы летят фактически в вакууме (бесполевом пространстве) и разделяются в соответствии с велич. отношения массы к заряду (у каждого белка разное отношения массы к заряду, поэтому и летят они с разной скоростью).
- Анализатор фиксирует время.
ESI (electrospray ionization) – электроспрейная ионизация, применяется в масс-спектрометрии, для получения ионов в газовой фазе из раствора. Механизм ионизации:
- Образование заряженных капель на срезе капилляра. Так, посредством приложенного напряжения происходит перераспределение заряда в растворе. Положительные ионы скапливаются у выхода. При достаточно сильном приложенном поле образуется струя из вершины конуса, которая далее разлетается на мелкие капли.
- Постепенное сокращение размеров заряженных капель за счет испарения растворителя и последующего распада капель на более мелкие за счет поверхностных эффектов вплоть до получения истинных ионов. Заряженные капли движутся сквозь атмосферу по направлению к противоположному электроду. Десольватация приводит к увеличению электрического поля на поверхности капель. В тот момент, когда поверхностное натяжение и отталкивание ионов выравниваются, происходит распад капли на несколько капель меньшего радиуса.
- Процесс разделения капель, сопровождающийся уменьшением их объема, повторяется до полного испарения растворителя и образования ионов в газовой фазе.
7) Флуоресцентная спектроскопия. Флуоресценция – кратковременном поглощении кванта света флюорофором (веществом, способным флуоресцировать) с последующей быстрой эмиссией другого кванта, который имеет свойства, отличные от исходного. Методом исследования структуры, динамики и функций биологических макромолекул — нуклеиновых кислот и белков.