Основы клинической энзимологии

(ФЕРМЕНТОЛОГИИ)

●

Интенсивная разработка теоретических основ и практических аспектов клинической ферментологии в последние десятилетия позволила получить новые исключительной важности сведения о строении, свойствах, методах выделения, кинетике и механизме действия, а также биологических функциях ферментов в норме и при патологии. Это открыло новую эру в вопросах ранней, доклинической идентификации возникающих в организме нарушений здоровья, позволило на основе высокоспецифичных и чувстви­тельных тестов получить представление о сущности возникающих нарушений, их патогенезе, следить за тенденцией развития и ин­тенсивности их, а также о времени завершения репаративных про­цессов в стадии реконвалесценции, и судить о витальном и функ­циональном прогнозе болезней. Установлено, что все виды обме­на веществ и все обменные реакции протекают при активном уча­стии ферментов.

На этой основе использование ферментных (энзиматических) методов лабораторного исследования крови животных, особенно в условиях перевода животноводства на промышленную технологи­ческую основу, трудно переоценить, так как чем раньше устанав­ливают нарушения здоровья, тем своевременней и эффективней бывают их лечение и профилактика.

Известно, что ферменты имеют белковую природу, молекуляр­ная структура их еще недостаточно ясна. Поэтому прямых методов изучения концентрации ферментов в биологических субстратах не существует, наоборот, широко используются методы косвенного изучения их констилляций по продуктам специфической актив­ности, что выражается, как правило, в условных единицах на еди­ницу объема субстрата при стандартных температурных условиях и рН. Клиническое значение при этом имеют 3 типа изменений ферментного зеркала в организме:

1) понижение активности или исчезновение имеющихся в кро­ви ферментов (гипоферментемия, аферментемия);

2) повышение их активности и концентрации (гиперферментемия);

3) появление в крови ферментов, несвойственных здоровому организму (неоферментемия).

Клиническая биохимия приводит все большее число примеров, снидетельствующих о нарушении функций отдельных ферментов и их координированной деятельности при самых разнообразных, порой неожиданных, ситуациях и в зависимости не только от па­тологических, но и от физиологических предпосылок. Кроме того, выявление гетерогенной природы ряда ферментов, связанное с от­крытием изоэнзимов (изоферментов), открыло новые возможнос­ти для использования ферментов в органоспецифической диагно­стике и терапии. Установлено много ферментов, существующих в двух и более формах (трансаминазы, энзимы конденсации, изомеразы). Как выяснилось, даже такие хорошо известные в клинике ферменты, как амилаза, фосфатаза, глюкозо-6-фосфатдегидрогемаза, фосфогексоизомераза, малат- и лактатдегидрогеназа, в орга­низме животных представлены также в виде нескольких молеку­лярных структур. Однако, несмотря на эти различия, они сохраня­ют свою специфичность к субстрату, в каталитическом превраще­нии которого они участвуют, что и используется при органоспецифической диагностике и идентификации метаболи­ческих изменений в организме.

Поскольку процессы обмена по своей сущности являются фер­ментативными, то принято считать, что в основе патогенеза раз­личных заболеваний лежат нарушения функций энзиматических систем.

Ферменты крови (плазмы, сыворотки) по происхождению ус­ловно можно разделить на 3 группы:

1) собственные ферменты крови, например, энзимы свертыва­ния крови (протромбин, проакцелерин, проконвертин, факторы IX — XII), церулоплазмины, холинэстераза и др.;

2) ферменты, поступающие в кровь из различных секретов (ду­оденальный сок, слюна и т. п.), например амилаза, липаза;

3) клеточные ферменты, появляющиеся в крови при поврежде­нии или разрушении клеток и тканей организма.

Огромный клинический материал свидетельствует о том, что ферментологические исследования функционального состояния органов и систем превышают по чувствительности другие приме­няемые с этой целью методы.

Вместе с тем недостатком многих ферментологических тестов сыворотки крови является их неспецифичность. Например, боль­шинство клеточных ферментов, особенно основных обменных це­пей (цикл Кребса, гликолитическая цепь, трансаминирование, дыхательная цепь и т. д.), встречается в большинстве тканей орга­низма, так что по изменению их констилляций без соответствую­щих дополнительных комплексных клинико-лабораторных иссле­дований трудно судить о том, какой орган и в какой степени по­врежден. Это еще раз подтверждает фундаментальный принцип того, что в любом случае речь идет не о болезни отдельного органа или системы, а о болезни организма, сущность которой, патогенез и степень нарушений можно объективно распознать лишь на ос­нове комплексного клинического исследования, изучения химиз­ма, структуры и функций отдельных органов и систем больного организма в целом.

Каталаза крови(Н₂О₂: Н₂О₂-оксиредуктаза) расщепляет двуоксид водорода согласно уравнению 2Н₂О₂→2Н₂О + О₂. В присут­ствии спиртов обладает способностью переносить кислород. Окисляет спирты: метанол, этанол, п-пропанол, изопропанол, изобутанол, гликол и коламин. Благодаря довольно простой мето­дике определение каталазной активности широко используется в лабораторной практике. Активность фермента зависит от количе­ства эритроцитов, поэтому необходим их подсчет для интерпрета­ции результатов исследования. Высокий индекс каталазной актив­ности (активность энзима в единице объема крови, деленная на количество эритроцитов в млн/мм³) отмечается при пернициоз,ной и других макроцитарных анемиях. Содержание каталазы в крови при пневмониях, заболеваниях печени (цирроз, гепатит), сердца, почек (нефрит, пиелонефрит, нефросклероз), в стадии реконвалесценции колеблется в нормальных пределах. При злокаче­ственных новообразованиях, после радиоактивного облучения ак­тивность каталазы снижается, но повышается в последние меся­цы беременности и при лактации. Активность энзима падает при отравлениях фосфором, мышьяком, свинцом, ртутью, наркоти­ками, цианидами, сульфидами, азидами, фторидами. Кофеин, теобромин, ацетоновые тела, алкоголь повышают активность ка­талазы.

Каталаза активно участвует в кислородном обеспечении тех тканей, в которые кислород поступает в меньших количествах, чем необходимо для нормального течения окислительных реак­ций. Каталаза эритроцитов вдвое активнее каталазы печени. Определение ее активности в крови дает объективные данные для суждения о степени обеднения организма железом при ане­миях.

Активность каталазы крови обычно определяют по методу Баха и Зубковой. Принцип метода основан на способности двух моле­кул пероксида водорода (Н₂О₂) разлагаться каталазой до 2Н₂О и О₂. Избыток пероксида водорода титруют раствором перманганата калия в присутствии серной кислоты:

2КМnО₄ + 5Н₂О₂ + ЗН₂SО₄ = 2МnSО₄ + 8Н₂О + SО₂ + К₂SО₄.

В опытной пробе определяют количество неразложившегося пероксида водорода в присутствии каталазы, а в контрольной про­бе — общее количество его в присутствии инактивированной ки­пячением каталазы. По разнице между контролем и опытом рас­считывают количество распавшегося в течение определенного времени (30 мин) пероксида водорода, дающее косвенное представление о каталазной активности.

Активность каталазы (каталазное число) делят на количество эритроцитов (млн/мм³). Частное от деления представляет собой каталазный индекс, по которому судят о результатах анализа.

Лактатдегидрогеназа(ЛДГ, дегидрогеназа молочной кислоты) катализирует обратимую реакцию восстановления пировиноградной кислоты в молочную при участии НАД • Н (восстановленной формы никотинамидаденилдинуклеотида):

Оптимум действия фермента отмечается при рН 7,4 и темпера­туре 39 °С, а также при рН 8,0 и температуре 20 °С. В заморожен­ных тканях и жидкостях фермент сохраняет активность длитель­ное время. Много его содержится в гладких и скелетных мышцах, миокарде, почках, обкладочных клетках желудочных желез, осо­бенно в поджелудочной железе, селезенке, легких и в тканях зло­качественных опухолей. В крови содержится в относительно небольшом количестве.

Оксалаты тормозят активность фермента в крови, поэтому кровь лучше стабилизировать гепарином. В гемолизированной крови активность ЛДГ многократно возрастает за счет высокой ее концентрации в эритроцитах. Продолжительное парентеральное введение ЛДГ вызывает образование в организме животных анти­фермента, снижающего до 75 % его активность.

Повышение активности ЛДГ в сыворотке крови бывает после хирургических операций, травмирования скелетных мышц, при мышечной атрофии не нейрогенной природы. При циррозе, вос­палении печени и обтурационной желтухе отмечают лишь незна­чительное увеличение активности энзима. Резкое повышение ЛДГ бытает при метастазировании рака в печень. Активность ЛДГ по­пытается при нефрите, панкреатите, пернициозной анемии, инфаркте миокарда, гемобластозах (лейкозе, ретикулезе) и при бере­менности.

У новорожденных животных активность ЛДГ в 1,5—2 раза иыше, чем у взрослых.

Большую ценность для диагностики заболеваний печени имеет определение изоферментов ЛДГ сыворотки крови методом электрофоретического расщепления ее на отдельные фракции. Обычно выделяют до 5 фракций (изоферментов), из них 5-я содержится в гепатоцитах. При заболеваниях печени содержание 5-го изофермента в сыворотке крови возрастает соответственно тяжести патологического процесса.

Активность ЛДГ определяют по Шенеду и Товареку. Принцип метода состоит в способности а-лактата в щелочной среде в при­сутствии ЛДГ и НАД окисляться в пируват, по количеству которо­го судят об активности фермента. Определение активности ЛДГ в сыворотке крови проводят также по методу Нейтельсона. Об ак­тивности ЛДГ сыворотки крови судят по количеству образовав­шейся под действием фермента в стандартных условиях пировиноградной кислоты, определяемой колориметрически с реактивом динитрофенил гидразином.

Нормальные величины активности ЛДГ сыворотки крови по этому методу колеблются между 200—450 ед.

Трансаминазы(аминотрансферазы) представляют собой фер­менты, катализирующие реакции переноса аминогрупп с амино­кислоты на кетокислоту с образованием новой кетокислоты и но­вой аминокислоты. Известно несколько трансаминаз, но в клини­ческой практике наиболее широко исследуют активность глютаминопировиноградной (ГПТ) и глютаминощавелевоуксусной (ГОТ) трансаминаз (глютаминоаспарагиновой и глютаминоалани-новой трансаминаз, или АСТ и АЛТ).

Коэнзимом трансаминаз является лиридоксальфосфат. Суль­фат магния повышает активность фермента вдвое. Трансаминазы довольно стабильны и в холодильнике сохраняют активность до 3 нед. После 6-месячного хранения сыворотки крови в холодиль­нике при 4 °С активность фермента снижается на 40 %.

Наивысшая активность ГОТ отмечается в миокарде, печени, почках, скелетных мышцах. ГПТ в наибольших количествах со­держится в печени и почках. Опухолевая ткань отличается относи­тельно низкой активностью трансаминаз.

Наибольшую ценность определение активности трансаминаз имеет для диагностики заболеваний печени и сердца. Так, при токсических гепатитах активность трансаминаз возрастает парал­лельно тяжести поражения. Индекс де Ритиса (ГОТ/ГПТ) при этом приближается к единице.

При циррозе печени активность ГПТ снижается, а ГОТ — зна­чительно возрастает, отчего индекс де Ритиса становится выше единицы. Отравление производными фосфора, токсическими плесневыми грибами повышает активность трансаминаз, а введе­ние небольших доз четыреххлористого углерода с целью дегель­минтизации при фасциолезе овец приводит к повышению транса-миназной активности в 1,5—4 раза по сравнению с нормой. Изме­нение активности трансаминаз считается весьма чувствительным тестом функционального состояния печени. При метастазирова-нии рака в печень активность трансаминаз колеблется в пределах 45—76 ед., причем активность ГОТ обычно выше, чем ГПТ.

При инфаркте миокарда активность ГОТ в крови значительно возрастает, в то время как активность ГПТ почти не изменяется или возрастает незначительно. При этом активность ГОТ в сыво­ротке крови повышается через 5—6 ч, достигая максимума через 24—30 ч от начала болезни. При благоприятном течении инфаркта миокарда к 7—10-му дню показатели активности ГОТ возвраща­ются к исходному уровню. При мелкоочаговых поражениях мио­карда активность ГОТ повышается незначительно и через 2—3 сут восстанавливается до исходного уровня.

Активность трансаминаз определяют по методу Райтмана и Френкеля в модификации Т. С. Пасхиной. Эта методика одновре­менного определения активности обеих трансаминаз (ГПТ и ГОТ) и настоящее время является наиболее простой, доступной и вместе с тем достаточно чувствительной.

Панкреатическая липаза(стеапсин) является наиболее важным ферментом, участвующим в переваривании нейтральных жиров. Она при соответствующих температурных условиях вызывает не только липолиз, но и приводит к синтезу из олеиновой кислоты и глицерина липидов и глицеридов. Температурный оптимум фермента 40 °С, но его активность сохраняется даже при темпе­ратурах, близких к О °С. При 45 °С он начинает распадаться и полностью разрушается при 55 °С в течение 10 мин. При ком­натной температуре липаза сохраняет липолитическую актив­ность 48 ч.

Липаза наиболее эффективно катализирует гидролиз триглицеридов. Слизистая оболочка тонкого кишечника также образу­ет липазу, которая активируется желчью. Липаза содержится также в плазме, эритроцитах, лейкоцитах, но главным источни­ком ее в крови служит поджелудочная железа. Содержание ли­па чы крови подвержено большим колебаниям и составляет 0,3— 1,5 ед/мл. Фермент выделяется с мочой в количествах от 0,1 до 0,75 ед/мин.

Активность липазы крови, как и амилазы, изменяется в зависи­мости от патологических состояний, особенно поджелудочной же-исчы. Так, при остром панкреатите активность ее возрастает, од­нако это отмечается не всегда и проявляется менее значительным повышением, чем активность амилазы. С другой стороны, повы­шение ее активности сохраняется более длительно, чем амилазной. Повышается активность липазы и при циррозе печени, желч­нокаменной болезни с явлениями обтурационной желтухи. При инфекционных болезнях активность этого фермента падает соот­ветственно тяжести болезни.

Холинэстеразаобладает способностью быстро инактивировать анетилхолин с образованием холина и уксусной кислоты. В насто­ящее время выделяют 2 вида холинэстеразы: истинную и ложную. Согласно международной номенклатуре ферментов (1962г.) для истинной холинэстеразы предложено название ацетилгидролаза ацетилхолина. Ложную холинэстеразу называют ацетилгидролазой ацилхолинов. Кроме того, выделяют самостоятельно бензоилхолинэстеразу (бензоилхолингидролазу). Для истинной холинэстеразы (ацетилгидролазы ацетилхолина) принято рабочее ее на­звание ацетилхолинэстераза, а для ложной холинэстеразы — холинэстераза. На практике пользуются термином холинэстераза как неспецифическим названием двух этих ферментов.

Среди холиновых эфиров оптимальным субстратом истинной холинэстеразы является ацетилхолин, а ложной — бутирилхолин. Важной особенностью истинной холинэстеразы является то, что она проявляет максимальную активность в строго определенной концентрации субстрата, избыток которого тормозит ее актив­ность. У ложной холинэстеразы это свойство отсутствует — при повышении концентрации субстрата ее активность растет. Разли­чают оба фермента также, пользуясь избирательными субстратами и ингибиторами.

Избирательным субстратом истинной холинэстеразы является ацетил-ᵦ-метилхолин. Он легко гидролизуется истинной холинэстеразой, но устойчив к действию ложной холинэстеразы. А специ­фические субстраты ложной холинэстеразы — бутирилхолин и бензоилхолин — истинной холинэстеразой практически не разру­шаются.

Истинная холинэстераза содержится в основном в сером веще­стве мозга, эритроцитах, симпатических ганглиях, двигательных концевых пластинках. Ложная холинэстераза содержится обычно в плазме крови, слизистой оболочке кишечника, поджелудочной железе и печени, однако в большинстве из перечисленных тканей и органов можно установить оба фермента.

Помимо основной функции — разрушать ацетилхолин холи­нэстераза влияет на клеточную проницаемость. Снижение холинэстеразной активности повышает проницаемость эритроцитов к ионам натрия и калия. В эритроцитах содержится холинэстеразы значительно больше, чем в плазме или сыворотке крови. Эритро­циты содержат в основном истинную холинэстеразу (ацетилхоли-нэстеразу), а сыворотка и плазма — ложную.

Оптимум активности ацетилхолинэстеразы при рН 7,5—8,0, а холинэстеразы при рН 8,5. В раннем постнатальном периоде ак­тивность холинэстеразы находится на уровне взрослых особей, но затем снижается почти вдвое. Голодание также приводит к паде­нию активности энзима, как и заболевания печени, являющейся депо холинэстеразы (в ней содержится в 6—7 раз больше фермен­та, чем в сыворотке крови). Фолиевая кислота повышает актив­ность энзима. При кровотечениях и кровопусканиях повышается его активность. При беременности и злокачественных новообра­зованиях активность фермента падает.

Изучение в динамике холинэстеразной активности крови дает достоверное представление о функциональном состоянии печени. При злокачественном поражении печени холинэстеразная актив­ность значительно и прогрессивно угасает. Острые инфекционные заболевания почти всегда вызывают уменьшение активности эн­зима, так же как и отравление фосфорорганическими и боевыми отравляющими веществами.

Недостаток холинэстеразы обусловливает накопление в тканях ацетилхолина, что приводит к падению тонуса парасимпатичес­кой нервной системы и, как следствие, к возникновению гиперса­ливации, слезотечения, потливости, поноса, рвоты, увеличению секреции бронхиальной слизи, клоническим и тоническим судо­рогам. В подобных случаях для блокады парасимпатических не­рвов инъецируют атропин.

Определение активности холинэстеразы крови приобретает важное значение также в связи с внедрением в лечебную практи­ку обладающих курареподобным действием холиновых эфиров дикарбоновых кислот и некоторых антихолинэстеразных препа­ратов.

Из состояний, связанных с повышением холинэстеразной ак­тивности сыворотки крови, клинический интерес представляет только нефритический синдром. При тяжелых нефритах актив­ность холинэстеразы увеличивается более чем в 3 раза.

Определение активности холинэстеразы приобрело первосте­пенное значение в диагностике заболеваний печени, угнетение которой свидетельствует о повреждении паренхимы органа вслед­ствие различных причин, и прежде всего отравлений.

Методика определения активности холинэстеразы в сыворотке крови по методу Хелла и Лукаша в модификации Борисова и Розенгарта состоит в определении времени, необходимого для обра­зования стандартного количества уксусной кислоты из избытка ацетилхолина. Концентрацию и рН буферного раствора подбира­ют так, чтобы величина рН изменилась во время опыта не более чем на единицу и была близкой в 8,5, соответствующей оптимуму активности химической среды.

Активность холинэстеразы выражают количеством уксусной кислоты (в микромолях), образовавшейся в 1 мин под воздействи­ем 1 мл сыворотки крови. В условиях метода образуется 1 мл 0,01 н. раствора уксусной кислоты, т. е. 10 микромолей, или в рас­чете на неразведенную сыворотку — 40 микромолей. Таким обра­зом, для выражения холинэстеразной активности достаточно раз­делить эту величину на время опыта в минутах и внести поправку на спонтанный распад ацетилхолина.

Фосфатазыкатализируют реакцию отщепления неорганичес­кого фосфора от органических фосфорных соединений. В зависи­мости от оптимума активности различают кислые и щелочные фосфатазы. Кислая фосфатаза содержится в предстательной желе­зе, печени, селезенке, почках, эритроцитах. Оптимальная актив­ность ее при рН 3,4-6,2. Щелочная фосфатаза синтезируется в остеобластах костной ткани, транспортируется кровью и выводится печенью через желчевыводящие пути. Оптимальная активность ее при рН 8,6—9,4.

Наибольшее применение в клинике нашло определение актив­ности щелочной фосфатазы, особенно при диагностике ранних форм алиментарных остеодистрофий (табл. 23). Так, при рахите, остеомаляции, генерализованном фиброзно-кистозном остите, гиперпаратиреоидизме активность щелочной фосфатазы возраста­ет в несколько раз (20—40 ед. Боданского или мг% в 1 ч при 37 °С). Механическая желтуха с обтурацией желчных путей (в отличие от гемолитической желтухи) сопровождается высокой активностью щелочной фосфатазы.