Микроклональное размножение цветочных культур

Иначе этот способ размножения называется методом изолированных тканей. Метод изолированных тканей начал развиваться в конце XIX — начале XX в. Х. Фехтингом, К.Х. Рехингером, Г. Габерландтом.

Длительный период велись исследования по подбору питательной среды для выращивания изолированных высокоспециализированных тканей, которые были неудачными из-за характера выращиваемых тканей. Только в 1932 г. Р. Й. Готре во Франции и Ф. Уайт в США независимо друг от друга добились положительных результатов в этих исследованиях, удачно подобрав состав питательной среды и выращиваемую ткань — меристему корня томата.

В 1952 г. Г. М. Морэль и К. Мартин получили безвирусные растения из меристемы, взятой от зараженного растения табака. После этих опытов метод верхушечной меристемы стали применять с целью оздоровления растений, зараженных вирусами. Среди наиболее значительных были работы, проведенные на декоративных растениях — хризантемах, орхидеях, фрезии, ирисе, луковичных и, главное, на американских сортах крупноцветковой ремонтантной гвоздики.

В настоящее время метод культуры изолированных тканей растений нашел широкое применение не только для получения безвирусных растений, но и для быстрого размножения сортов, у которых при семенном размножении не получается стабильного по декоративным качествам потомства (гербера), а также с целью получения от исходных сортов растений со спортовыми отклонениями. Возникновение спортов при этом обусловлено мутагенным действием регуляторов роста, которые могут вызывать полиплоидизацию растущих каллюсных клеток. Для этого используют не только апикальную меристему растений, но и части листьев, цветоносов, цветков (пыльники, цветоложе).

Для выращивания изолированных тканей требуется определенный микроклимат в культивационных помещениях, стерильность всех инструментов и питательных сред, система контроля за качеством получаемого материала (вирусная стерильность, сохранение сорта).

Выращивание изолированных тканей делят на четыре этапа:

1) эксплантация (вычленение) исходной ткани растения; на этом этапе необходимо получить свободную от видимой инфекции ткань, добиться ее выживания и быстрого роста;

2) собственно микроразмножение, при котором нужно обеспечить увеличение количества микрочеренков;

3) укоренение полученных микропобегов и сохранение их в прохладном помещении;

4) закаливание растений, повышение их устойчивости к внешней среде (рис. 1.3).

Метод выращивания изолированных тканей включает:

- приготовление и стерилизацию питательной среды;

- подготовку и стерилизацию растительного материала и оборудования на этапе вычленения тканей;

- изоляцию и посадку кусочков тканей на питательную среду;

- выращивание ткани в термостатированных условиях (получение растений-регенератов, или v/Yro-растений);

- пересадку растений в оранжерейные субстраты и выращивание из них маточных растений в условиях, исключающих возможность вирусного инфицирования;

- проверку растений на наличие вирусных заболеваний и отбор здоровых растений;

- получение здорового посадочного материала от здоровых маточников.

Рис. 1.3. Получение растений из меристемы на примере гвоздики (по Н. Lobst, 1973)

Для выращивания изолированных тканей необходимы специализированные помещения: комнаты для стерилизации сред и для мойки посуды; боксы для изоляции, пересадки тканей и деления растеньиц; термостатная для выращивания изолированных тканей и укоренения микрочеренков.

В термостатной температуру воздуха поддерживают в пределах ±2⁰С от оптимальной для конкретного вида. Декоративные растения по отношению к температуре в период выращивания их методом культуры тканей делят на три группы. Оптимальные пределы температур для этих групп равны 20 —22, 22 —27 и 28 — 29⁰С. Поэтому в термостатной температура должна регулироваться в пределах от 20 до 29⁰С. Оптимальная относительная влажность воздуха 70 %. Более высокая относительная влажность воздуха может привести к увлажнению ватных пробок и инфицированию культур в пробирках, а более низкая — к высыханию среды, содержащей агар, или к изменению концентрации солей в жидкой среде. Воздух в термостатной должен быть чистым, без посторонних примесей. Освещение обеспечивается люминесцентными лампами. При использовании других источников важно учитывать их теплоотдачу, так как при высокой теплоотдаче может наблюдаться перегрев культур. Освещенность 1 —2 тыс. лк.

Важнейший элемент технологии культуры растительных тканей — питательная среда. В результате многочисленных исследований с разными видами растений создано много сред, агаризованных полутвердых и жидких. Большинство из них включают в себя минеральные макро- и микроэлементы, углеводы, витамины, аминокислоты, регуляторы роста. Наиболее часто используют среды Уайта, Мореля, Мурасиге—Скуга, Линсмейера—Скуга, Буюса (прил. 2).

Все среды содержат регуляторы роста — ауксины и цитокинины, без которых изолированные клетки нормальных растений не могут расти на искусственных средах. Из всех разработанных сред среда Мурасиге—Скуга наиболее универсальна и эффективна для большинства декоративных культур. Однако для каждого вида разрабатывают собственные модификации сред.

Развитие кусочка ткани на среде может происходить двумя путями:

1) непосредственно образуется проросток и из него растеньице;

2) образуется каллюс, который затем пересаживают (пассируют) на другую среду, где он дает начало побегам.

Развитие растительной ткани в пробирках зависит от разных причин: размеров выделенной апикальной меристемы (гвоздика), соотношения в питательной среде регуляторов роста и условий, в которых находятся растения.

Для получения растений-регенератов важно обеспечить последовательность прохождения фаз органогенеза. Первая фаза органогенеза — переход недифференцированной растущей ткани к образованию регенерационной меристемы и закладке стеблевых точек роста. Эта фаза обеспечивается преобладанием в среде цитокининов над соединениями с ауксиновой активностью. Вторая фаза органогенеза — переход возникших образований к активному формированию побегов и корней. Для этой фазы необходима среда с относительно низким количеством (по сравнению со средой Мурасиге—Скуга) минеральных солей и содержанием веществ с ауксиновой активностью. Отбор соответствующей питательной среды для прохождения первой и второй фаз органогенеза — наиболее сложная и важная задача. Для каждого вида, а иногда и сорта эту задачу решают отдельно, что служит причиной многообразия питательных сред.

В настоящее время метод культуры изолированных тканей растений нашел широкое применение в мире. В нашей стране он начал развиваться с конца 50-х гг. XX в., когда в Институте физиологии растений им. К.Е. Тимирязева была создана лаборатория культуры изолированных растительных тканей и органов. Сейчас такие лаборатории имеются в Научно-исследовательском институте горного садоводства и цветоводства (Сочи), в Научно-исследовательском зональном институте садоводства Нечерноземной полосы (Москва). Этот метод используется во многих цветоводческих хозяйствах, где имеются промышленные лаборатории: Московском оранжерейном комплексе (Одинцово), колхозе им. С.М.Кирова Балашихинского района, совхозе «Победа» (Клин).