Визначення концентрації розчину еозину за допомогою фотометра

Мета роботи: Вивчити принцип визначення концентрації речовин у розчинах за коефіцієнтом пропускання або екстинкції розчинів та навчитися будувати калібрувальну криву.

Прилади і приладдя:фотометр КФК-2, кювети (скляні) на 20 мм, дистильована вода, стандартні розчини еозину.

Матеріал, який необхідно засвоїти перед виконанням роботи:1) Інтенсивність світла. 2) Закон Бугера-Бера. 3) Коефіцієнт пропускання світла та екстинкція.

Література

1. Грабовский Р.И. Курс физики: Учеб. пособие для с.-х. ин-тов. – М., 1979. – 552 с.

2. Розумнюк В.Т., Якименко І.Л. Фізика. Основні поняття, явища і закони. – Біла Церква, 2004. – 71 с.

Теоретичні відомості

При проходженні світла крізь будь-яке середовище завжди має місце часткове або повне його поглинання, що зумовлене перетворенням електромагнітної енергії в теплову та інші види енергії.

Речовини, що слабо поглинають світло називають прозорими; речовини, що мають сильну поглинальну здатність – непрозорими. Однак такий поділ має відносний характер, оскільки прозорість залежить не тільки від природи речовини, але й від товщини її шару. Наприклад, алюміній прийнято вважати непрозорою речовиною, а воду – прозорою. Але дуже тонкий шар алюмінію достатньо добре пропускає світло, тоді як товстий шар води практично непрозорий.

Для кількісної оцінки процесу поглинання світла користуються поняттям інтенсивності світла І.

Інтенсивність світла(або густина потоку світлової енергії) дорівнює енергії світла W, що переноситься за одиницю часу через одиницю площі поверхні, перпендикулярній напрямку розповсюдження світла.

I = [Вт/м²], (1)

де S – площа поверхні, через яку розповсюджується світло; t – час розповсюдження світла.

Рис. 17.1.

Нехай паралельний потік світлових променів падає на поглинаючу речовину перпендикулярно до її поверхні (рис. 17.1). Зміна інтенсивності I світла, що відбувається при проходженні світла крізь шар речовини у зв’язку з поглинанням, пропорційна товщині шару x та інтенсивності падаючого на шар світла I₀. Згідно із законом Бугера-Бера:

I = I₀e^-kх, (2)

де І₀ – інтенсивність світла, що падає на поверхню;

І – інтенсивність світла, яке пройшло крізь речовину;

k – коефіцієнт поглинання, який характеризує поглинаючу здатність речовини та не залежить від товщини шару.

З формули (2) маємо, що при х = 1/k:

I₀/I = e ≈ 2,72.

Таким чином, коефіцієнт поглинання світла k речовиною є величина, обернено пропорційна товщині хтакого шару даної речовини, при проходженні якого інтенсивність світла послаблюється в е разів (приблизно в три рази).

Відношення інтенсивності пройденого через тіло світла до інтенсивності падаючого на нього світла І/І₀ називається пропусканням τ:

τ = I/I₀· 100 %.

Пропускання вимірюється у відсотках та змінюється від 0 до 100 % для повністю непрозорих і повністю прозорих тіл, відповідно.

Для розчинів значення τ залежить від їх концентрації, тому за τ знаходять концентрацію досліджуваного розчину. Крім того, у фотометрії широко користуються поняттям екстинкції.

Екстинкція Е – величина, що виражає ослаблення потоку світла при його розповсюдженні у речовині за рахунок поглинання та розсіювання світла. Екстинкція – величина безрозмірна та змінюється від 0 до .

Коефіцієнт пропускання та екстинкція зв’язані співвідношенням:

Е = lg 1/τ = lg I₀/I.

Для визначення екстинкції або коефіцієнта пропускання використовують фотометри та спектрофотометри.

Фотометр фотоелектричний –це оптичний прилад, що використовується для вимірювання коефіцієнтів пропускання та екстинкції прозорих розчинів, а по них ─ визначення концентрації сухої речовини у розчинах.

Принцип роботи фотометра базується на порівнянні світлового потоку Ф₀ (потоку світлової енергії), що проходить через розчинник або контрольний розчин, по відношенню до якого відбувається вимірювання, та світлового потоку Ф, що проходить крізь досліджуване середовище. Світлові потоки Ф₀ та Ф фотоприймачем перетворюються в електричні сигнали U₀, U та U_Т (U_Т – сигнал при неосвітленому фотоприймачі) та передаються на стрілку мікроамперметра, яка відхиляючись від позначки „0” показує екстинкцію (Е) або коефіцієнт пропускання (τ, %) досліджуваного розчину. Коефіцієнт пропускання (τ) досліджуваного розчину визначається як відношення потоків (Ф₀ і Ф) або сигналів (U₀, U та U_Т):

τ = 100 % = 100 %.

Екстинкція (Е):

Е = lg = lg .

В даній роботі використовують фотометр КФК-2 (рис. 17.2). В оптичну систему фотометра входить джерело світла (спеціальна лампа розжарювання), світлофільтри, система лінз та детектор світла. Система світлофільтрів фотометра забезпечує використання світла тільки певних довжин хвиль, на відміну від спектрофотометрів, у яких можна виставити будь-яку довжину світлової хвилі.

Величина екстинкції та коефіцієнт пропускання досліджуваного розчину реєструються мікроамперметром 1. Кювети з досліджуваним та контрольним розчинами встановлюються в кюветотримач, захищений від зовнішнього світла кришкою 2. За допомогою рукоятки 7 змінюють положення кювет відносно світлового променя, а рукояткою 6 змінюють світлофільтри. Ручкою 8 встановлюють чутливість приладу. З правого боку на корпусі розміщені ручки для встановлення „0” (4 – „грубо”, 3 – „точно”).

Рис. 17.2.

На сьогодні у ветеринарній практиці та інших галузях аграрного сектору широко застосовують колориметричний метод визначення концентрації речовини у розчині.

Багато сполук, які слабо поглинають світло видимої області, після реакції з іншими речовинами дають забарвлені продукти, кількість яких корелює з концентрацією вихідної речовини. Таку кольорову реакцію використовують для визначення концентрації цих речовин. Речовини, що утворюються в ході таких реакцій поглинають світло тільки певної довжини хвилі, тому необхідно знати, який спектр світла поглинає утворена речовина.

Для того, щоб знайти концентрацію речовини у дослідній пробі спочатку будують калібрувальну криву. З цією метою здійснюють хімічну реакцію з відомими концентраціями досліджуваної речовини у розчині. За допомогою фотометра або спектрофотометра визначають величину екстинкції або коефіціента пропускання цих розчинів після постановки хімічної реакції, порівняно з робочим розчином, в якому досліджувана речовина відсутня, тому кольорова реакція в ньому не відбувається (робочим розчином встановлюється нульове значення екстинкції або коефіцієнта пропускання). Визначивши ці показники будують калібрувальну криву, де на осі абсцис (Х) відкладають коефіцієнт пропускання або екстинкцію кожного розчину, а на осі ординат (Y) ─ концентрації розчинів.

Користуючись цим калібрувальним графіком можна визначити невідомі концентрації розчинів вимірявши для них значення τ або Е та знайшовши за графіком концентрацію досліджуваного розчину.

В даній роботі ми не проводимо кольорову реакцію, а знаходимо концентрацію в розчині еозину, який широко використовується у гістохімії.

Порядок виконання роботи

1. За допомогою ручки 6 встановити світлофільтр, що пропускає світлові промені довжиною хвилі 540 нм.

2. Виставити чутливість приладу. Для цього ручку 8 встановити у крайнє ліве положення.

3. Кювету № 1 (товщина 20 мм) заповнити дистильованою водою та встановити в кюветотримач фотометра. Закрити кришку фотометра та за допомогою ручок "настройки" (3,4) встановити стрілку мікроамперметра (1) в положення „0”.

4. Кювету № 2 почергово заповнити розчинами еозину з концентраціями 0,001; 0,0025; 0,005 та 0,01 %. Виміряти екстинкцію даних розчинів. Вимірювання кожного розчину провести триразово.

5. Побудувати калібрувальний графік, де на осі ординат (Y) відмітити концентрації розчинів, а на осі абсцис (Х) – екстинкцію кожного розчину.

6. Визначити концентрацію еозину в розчині з невідомою концентрацією.

Контрольні питання

1. Що таке коефіцієнт пропускання та екстинкція?

2. Принцип дії фотометра та його використання.

3. Принцип визначення кількості речовини в розчині за інтенсивністю зафарбування.

4. Що таке калібрувальна крива і для чого її будують?

Лабораторна робота № 18 (30)