Cистема капиллярного электрофореза «капель»
Капиллярный э/ф использовали давно. Проблема – нет синхронизации, а одного капилляра для детекции не хватало.
Но прогресс на месте не стоит. «Капель». На западе тоже производится. Экологи любят – для детекции загрязнения тризолом, фенолом.
q кварцевые с внешним полиимидным защитным покрытием капилляры (внутр. диаметр 50-75 мкм, внешний 365 мкм, общая длина 30-100 см);
q положительные и отрицательные напряжения до 30 кВ;
q для ввода пробы применяют избыточное давление (гидродинамический способ) или высокое напряжение (электрокинетический). Объем пробы составляет несколько нанолитров;
q для регистрации электрофореграмм используют УФ-детектирование непосредственно в капилляре, в прямом и косвенном вариантах
Двойной электрический слой. Стекло капилляра, при определенных рН протонируется и приобретает заряд «-», соответственно 1-й слой катионов, который прилежит к этой поверхности, практически не может двигаться под действие ЭП, т.к. электростатическое взаимодействие со стеклом сильнее.
Двойным слоем моно управлять, используя рН.
А поле здесь очень высокое – вплоть до кВ на см. Позволяет процесс проводить очень быстро. В геле такое делать нельзя! Возникает аномальная зависимость подвижности от размера. А в свободной среде – можно.
В середине капилляра – детектор, чтобы можно было использовать оба направления.
Нанесение образцов – гидростатически или электрокинетически, или комбинированно.
Гидростатичски – небольшой объем поместить засчет всасывания-засасывания жидкости. Есть возможность управлять макроскопическим потоком, и определенный столбик образца мы получим.
Электрокинетически – конец капилляра помещаем в пробирку. Туда же помещается второй электрод, катод, если нас анионы интересуют, под дейтвием ЭП в-ва попадают в капилляр, ведем недолго, чтобы зона была узкая, а потом собственно начинам э/ф.
Насколько прибор универсален?
Позволяет анализировать даже неионогенные в-ва, которые строго говоря в электрическом поле двигаться не должны.
Si=0 -> Si(OH)2 Ka1 ~ 4 x 103
При C однозарядного электролита 1 – 0.1 mМ толщина двойного электрического слоя составляет в среднем 30 – 50 мкм. При диаметре канала 50 – 100 мкм практически вся жидкость, заполняющая капилляр, представляет собой диффузную часть двойного электрического слоя.
Электроосмотический поток направлен к катоду.
Используют Мицеллярную электрокинетическую хроматографию (МЭКХ):
использование встречного потока мицелл детергента (ДСН) для разделения нейтральных молекул форм веществ (аналог ВЭЖХ) .
изображает из себя хроматограф – гетрофазная система.
Раствор с достаточно высоким содержание детергента, образуются мицеллы (1 уровня). Если еще больше – образуются мицеллы 2 порядка. И эти макроскопические шарики – наша вторая фаза, причем гидрофобная. Мицеллы несут большой отрицательный заряд. В ЭП будут двигаться с контролируемой скоростью и синхронно, т.к. размер задается концентрацией. А потом поместим толуол и будем радостно за ним наблюдать (надо только как-то детектировать, но это задача решаемая).
Э/ф в псевдогеле. НК
"ГЕННЫЙ АНАЛИЗАТОР" ABI 310
(Applera = Applied Biosystems+Сelera Genomics)
Принцип тот же, трение о матрикс. Только гель не совсем честный, иначе мы его ни за что из капилляра не вытряхнем, а одноразовые капилляры – дорого.
Используется псевдогель, модифицированный линейный ПАА. Есть боковые группы, которые создают виртуальный гель засчет нековалентных взаимодействий. Начинает приближаться к агарозе. Этакий жидкий кристалл. Но никто не проверял. Хотя хорошо отфильтрованный линейный ПАА, в узком диапазоне длин, тоже работает.
Позволяет разделять продукты реакции Сенгера. Или просто разделять фрагменты – ГенСкан.
При разделении некоторые фрагменты имеют разную массу, но одинаковую подвижность – просто у флюорохромов разные заряды. Даже сдвигают подвижность до 1 звена.
Современные приборы – до 16 капилляры.