Уменьшение содержания хлорофилла в листьях растений в результате антропогенного и техногенного воздействия

Цель работы ‑ определения хлорофилла в листьях растений, находящихся в условиях техногенной нагрузки, фотометрическим методом.

Количество хлорофилла (по сырой или сухой массе) колеблется от 0,08 до 0,14 мг/г или от 0,3 до 1,3 % абсолютно сухой массы листа (насаждения сосны). Данные относительно использования содержания хлорофилла (и других пигментов) как биоиндикационных признаков, в научной литературе противоречивы. Ряд немецких ученых считает этот признак недостаточно информативным и специфичным, хотя первой стадией видимых хлорозов листьев как раз и является разрушение хлорофилла под влиянием неблагоприятных факторов. В то же время отечественные исследователи показали, что у чувствительных к загрязнению видов (липы, клена) наблюдается снижение содержания хлорофилла еще до появления видимых изменений и это биоиндикационным признаком.

Неспецифичность этого индикатора в том, что недостаток в почве азота, железа и других элементов, быстро сказывается на окраске листьев в результате разрушения хлорофилла в них и, этот признак очень часто используется для оценки низкого плодородия почв. Это надо учитывать и использовать этот показатель при биоиндикации в сочетании с другими признаками.

Для оценки степени загрязнения наземных экосистем или их составляющих листья собирают из средней части кроны в первой половине вегетации, учитывая условия произрастания (освещенность, минеральное питание, обводненность и др.). В качестве биоиндикаторов в городской среде рекомендуется использовать следующие газочувствительные виды: липу мелколистную, клен платанолистый, каштан конский, ель обыкновенную, сосну обыкновенную.

Метод основан на извлечении хлорофилла из листьев растворителями (спирт, ацетон) и определении его количества на фотоэлекроколориметре или спектрофотометре. Для учебной работы можно использовать и комнатные растения, выращенные специально в сосудах на гумусной почве с поливом водой и на малоплодородной почве с поливом раствором соли какого-либо тяжелого металла.

Оборудование, реактивы, материалы:

Весы; фотоэлектроколориметр ‑ ФЭК; насос Камовского или электрический; колба Бунзена с пробкой и стеклянным фильтром № 2, № 3 (в случае отсутствия колбы Бунзена, стеклянных фильтров и насоса, их можно заменить центрифугированием вытяжки хлорофилла); ступки малые с пестиками; стеклянные палочки; ножницы; толченое и просеянное стекло; мерные колбы на 100 и 50 см³; калька; вазелин; фильтровальная бумага; медный купорос CuSО₄ 5Н₂О; биохромат калия К₂Сr₂O₇, 7%-ный раствор аммиака; листья растений-индикаторов, собранные в "загрязненной" и "чистой" зонах.

Порядок выполнения работы:

1. Определение хлорофилла в листьях можно проводить как на свежем, так и на фиксированном материале. Фиксацию осуществляют текучим паром (5 мин) или сухим жаром (при 105⁰С в течение 5-10 мин).

2. Листья нарезают мелкими кусочками, заворачивают в марлю и погружают в кипящий насыщенный раствор поваренной соли на 1-2 минуты. За это время материал обезвоживается и ферменты убиваются.

3. Затем материал промывают текучей водой в течение 0,5 минуты, встряхивают для удаления влаги. Высушивают в тени не менее 2-х суток или в термостате при температуре не выше 40⁰С.

4. При работе с сухим материалом берут навеску 0,5-1 г, со свежим - 1-2 г. Предварительно определяют влажность листьев. Навеску растительного материала (исключая жилки) тщательно измельчают в фарфоровой ступке с битым стеклом, добавляя мел или углекислый магний. Извлечение хлорофилла из сухого материала можно производить 90 %-ным спиртом или 80-85 %-ным ацетоном, а из свежего ‑ 96-98 %-ным спиртом или абсолютным ацетоном.

5. К растертому растительному материалу прибавляют немного растворителя, и материал продолжают растирать вместе с растворителем.

6. В колбе Бунзена в отверстие пробки укрепляют стеклянный фильтр № 2 или № 3 (диаметр фильтра должен соответствовать количеству исследуемого материала). Колбу соединяют с насосом и производят отсасываниё жидкости. Жидкость из ступки сливают по стеклянной палочке в воронку-фильтр, предварительно смазав вазелином снаружи носик ступки. В ступку приливают 4-5 см³ растворителя и вновь растирают в течение минуты, затем опять сливают в воронку. Эту манипуляцию повторяют 2-3 раза, затем переносят на фильтр всю растертую массу, уплотняют ее палочкой и отсасывают. Ступку ополаскивают несколько раз растворителем, выливая его на уплотненный материал в воронку, где ему дают постоять 2-3 минуты, после чего отсасывают. Промывание ведут до тех пор, пока стекающий раствор не станет бесцветным.

7. Затем экстракт переносят в мерную колбу на 50 см³, ополаскивая несколько раз, промывают колбу Бунзена и выливая в мерную. Вытяжку доводят до метки растворителем.

8. Колориметрирование раствора производят на фотоэлектроколориметре с красным светофильтром. Если жидкость окрашена в интенсивно зеленый цвет, ее необходимо разбавить, так как больших концентрациях величины на ФЭКе могут выходить за пределы разрешающей способности прибора.

9. Для пересчета хлорофилла на стандартные величины используют раствор Гетри, который готовится следующим образом: 1) 1 %-ный раствор CuSO₄ 5H₂O (берут синие кристаллы), 2) 2 %-ный раствор K₂Cr₂O₇, 3) 7 %-ный раствор аммиака (на 7 см³ 18 %-ного аммиака надо взять 11 см³ воды). Для изготовления стандарта в мерную колбу емкостью 100 см³ точно отмеривают растворы (CuSO₄ 5H₂O – 28,5 см³, K₂Cr₂O₇ – 50 см³, аммиака – 10 см³), доводят дистиллированной водой до метки и перемешивают. Раствор Гетри по окраске колориметрически эквивалентен раствору кристаллического хлорофилла по содержанию последнего 85 г в дм³;

10. Методом разбавления стандартного раствора строят калибровочную кривую, где по оси абсцисс откладывают содержание хлорофилла (г/дм³), а по оси ординат ‑ оптическую плотность. Калибровочную кривую строят от концентрации 0,085 г/дм³ (1 см³ исходного раствора и 99 см³ воды) до 7,65 г/дм³ (90 см³ исходного раствора и 10 см³ воды).

По полученным данным определяют концентрацию хлорофилла в опытных образцах по калибровочной кривой (С_хл, мг/дм³). Затем вычисляют количество хлорофилла в 50 см³ экстракта (С_хл50, мг) по формуле:

, (5)

Затем вычисляют количество хлорофилла в мг/г листа (С_{хл вес}) и в % (С_хл%) (по сырой или сухой массе) по формулам.

, (6)

где m – масса растительного материала по сухому или сырому весу, г.

. (7)

Схема записи результатов анализов

№	Навеска листьев, г	Показания ФЭКа	Количество хлорофилла	Содержание хлорофилла в листьях
по калибровочной кривой, г/дм3	г в 50 см3	г/кг (мг/г)	%

Вопросы для самоподготовки:

1. Какое количество хлорофилла (по сырой или сухой массе) содержится в абсолютно сухой массе листа?

2. Какие газочувствительные виды деревьев рекомендуется использовать в качестве биоиндикаторов в городской среде?

3. Принцип метода определения концентрации хлорофилла в листьях?

4. Какие виды деревьев чувствительных к загрязнению?

5. С помощью какого вещества моделируют раствор хлорофилла при построении калибровочной кривой?

БИОИНДИКАЦИЯ ВОДНЫХ СРЕД

Лабораторная работа №6.

БИОЛОГИЧЕСКИЙ КОНТРОЛЬ ВОДОЕМА МЕТОДОМ САПРОБНОСТИ

Цель работы — определение сапробности водоема.

Основные понятия

Под сапробностью принято понимать степень распада органических веществ в загрязненных водоемах. Сапробионты, или сапробные организмы могут служить индикаторами загрязнения или различных степеней разложения органических веществ в водоеме. Распад органики в водоеме приводит к дефициту кислорода и накоплению ядовитых продуктов (углекислоты, сероводорода, органических кислот и др.). Способность организмов обитать в условиях разной степени сапробности объясняется потребностью в органическом питании, устойчивостью к дефициту кислорода и выносливостью к вредным веществам, образующимся в процессе разложения органического вещества (табл. 10).

Таблица 10 – Основные характеристики зон сапробности

Показатель	Зона
полисапробная	альфа-мезосапробная	бета-мезосапробная	олиго-сапробная
Кислородные условия	Анаэробные	Полуанаэробные	Аэробные
Азотистые соединения	Белковые вещества	Аммиак, аминокислоты	Аммонийные соли, нитриты, нитраты	Нитраты
Сероводород	Много	Порядочно	Мало	Нет
Загниваемость	Загнивает	Загнивает
Содержание бактерий в 1 см3 воды	Сотни тысяч, миллионы	Сотни тысяч	Десятки тысяч	Сотни, десятки
Преобладание отдель­ных видов	Очень сильное	Сильное	Слабое	Обычно слабое
Разнообразие видов	Очень малое	Небольшое	Значительное	Очень большое
Количественное богатство форм	Часто высокое или низкое	Очень высокое	- » -	Невысокое
Смена сообществ	Катастрофическая	Часто катастрофическая	Довольно медленная
Потребность организмов в кислороде	Ничтожная	Слабая	Большая	Очень большая
Главные группы организмов	Бактерии, бесцветные жгутиковые, серные бактерии, инфузории	Грибы, бактерии, инфузории, сине-зеленые водоросли, зеленые жгутиковые	Сине-зеленые водоросли, диатомовые водоросли, зеленые водоросли, зеленые жгутиковые, инфузории, коловратки, ракообразные, рыбы	Зеленые водоросли, диатомовые водоросли, перидинеи, хризомонады, коловратки, мшанки губки, ракообразные, рыбы

Принцип метода сапробных индикаторов основан на взаимосвязи организмов со средой обитания. Понятие сапробности, с одной стороны, приближается к значению эвтрофикации, так как включает трофическую характеристику, а с другой стороны, сапробность близка к токсичности или загрязненности, поскольку характеризует действие в среде отрицательных факторов (дефицит или отсутствие кислорода, продукты разложения органики и т.д.). Таким образом, понятие сапробности приобретает значение характеристики качества воды.

Организмы водоема относятся к планктону и бентосу, ряд из них составляет перифитон (обрастания). В планктон включают те формы животных и растений, которые проводят всю жизнь во взвешенном состоянии в толще водоема. К фитопланктону принадлежат микроводоросли, к зоопланктону — простейшие животные.

Наиболее показательны для оценки загрязнения водоема бентос и перифитон. В состав биоценозов бентоса входят все формы растений и животных, которые своей жизнью тесно связаны с дном водоема. Организмы обрастания прикрепляются к камням, днищам судов, железным и бетонным арматурам мостов.

В полевых условиях для оценки сапробности проводят предварительное обследование водоема. Следует указать, что водоем реагирует на загрязнение целым комплексом взаимосвязей биотической и абиотической среды. Поэтому при биологическом исследовании изучают водоем в целом - воду, дно, берега, а не только организмы, населяющие водоемы. Прежде чем приступить к обследованию, необходимо иметь сведения о гидрологическом режиме водоема: расходах воды, характере водосборной площади, расположении, количестве и качестве выпусков сточных вод, наличии загрязненных территорий вдоль берега водоема. В момент осмотра водоема в полевом журнале отмечают температуру воды, ее прозрачность, наличие или отсутствие пленок на поверхности, запах и особенности цвета воды, наличие водной растительности, загрязнение берегов, заиленность дна и характер ила, пленки нефтепродуктов на дне и поверхности водоема.

При окончательном обследовании водоема производят отбор и обработку проб. Пробы отбирают ниже источника загрязнения, по возможности, на всем протяжении загрязненности водоема, а также для сравнения — в чистом пункте выше сброса. Для полной биологической диагностики водоема должны быть учтены все сообщества: перифитон, бентос, планктон, плейстон, нектон, макрофиты. Но практически при единичном обследовании можно ограничиться рассмотрением наиболее типичных сообществ: например, в малых водостоках исследуют перифитон, в реках — планктон, бентос и перифитон, в прудах — заросли макрофитов и т.д.

Перифитон собирают скребком, переносят в лабораторию в термосе, чтобы сохранить пробу для микроскопирования в живом виде. Впоследствии фиксируют формальдегидом, доведя его концентрацию в пробе до 2-4%, и затем окончательно определяют виды. Учитывают сапробность и частоту встречаемости организмов.

Зоны сапробности выделяют по различной степени разложения органического вещества. От чистого водоема к загрязненному увеличивается индекс сапробности водоема: олигосапробные — 0-1,50 → бета-мезосапробные — 1,51-2,50 → альфа-мезосапробные — 2,51-3,50 → полисапробные — 3,51-4,0. Индексы обозначаются греческими буквами ο → β → α → ρ.

Перечень видов-индикаторов с указанием принадлежности их к зонам сапробности имеется в методическом руководстве «Унифицированные методы исследования качества воды» . Некоторые из них приводятся в Приложении, табл. 1.

Для количественного учета просматривают 50 полей зрения не менее чем на трех препаратах — стеклах обрастания. Число организмов оценивают по шкале частот после пересчета на 100 полей зрения соответственно категории крупности (Приложение табл. 2): 1-я категория — организмы размером до 50 мкм; 2 я категория — 50-200 мкм; 3-я категория — 200-1000 мкм.

Частоту встречаемости учитывают по общепринятой в биоиндикационных исследованиях девятибалльной шестиступенчатой шкале со следующими обозначениями (Приложение табл. ).

Для единообразия количественного учета и выражения данных в шкале сапробности можно результаты по просчету планктона и микробентоса выразить в значениях частоты встречаемости (Приложение табл.).

Наиболее распространен способ определения сапробности вооема по методу Пантле и Бука. Данный метод позволяет сравнить состояние водоема в разных пунктах, например по продольному профилю реки, и представить результаты в цифровом и графическом виде.

Таблица 6.4 Шкала оценки качества воды по системе сапробности

Класс качества водоема	Характеристика воды	Индекс сапробности по Пантле и Буку
	Очень чистая	< 1,00
	Чистая	1,00-1,50
	Умеренно (слабо) загрязненная	1,51-2,50
	Загрязненная	2,51-3,50
	Грязная	3,51-4,00
	Очень грязная	>4,00

Зонам сапробности (S) придается цифровое значение от 0 до 4 в порядке возрастания загрязнения. Определяется частота встречаемости организмов (h) в сообществе. Обе величины входят в формулу для определения индекса сапробности:

Ind S= Σ (Sh)/Σh, (8)

Сапробность организмов определяется по спискам, приведенным в Приложениях. Средний индекс сапробности для каждого данного участка водоема получают, выводя среднее арифметическое из индексов разных сообществ (бентос + планктон + обрастания и т. д.). Пример графического изображения сапробности по продольному профилю реки приведен на рис. 6.

Рис. 6 ‑ Графическое изображение сапробности по продольному
профилю реки

Оборудование и материалы:

Микроскоп, аквариум или проба воды из природного водоема, предметные и покровные стекла, пинцет.

Порядок выполнения работы

1. Получить у преподавателя «стекла обрастания» с разным временем экспозиции в аквариуме (от недели до полутора-двух месяцев).

2. Рассмотреть под микроскопом препараты с объективом х40.

3. Используя ключ для определения главных групп водных беспозвоночных животных и определители водорослей, составить таблицу видового многообразия. Оценить сапробность обнаруженных организмов по табл. 11.

4. Произвести учет организмов по частоте встречаемости по табл. 12.

5. Определить сапробность водоема по методу Пантле и Бука (см. пример в Приложении). Определить класс качества воды с помощью табл. 13.

В отчете привести все сведения из п.п. 3-5, в том числе рисунки обнаруженных видов.

Вопросы для самоподготовки:

1. Что такое сапробность водоема?

2. От чего зависит индекс сапробности?

3. Назовите зоны сапробности водоемов?

4. Назовите классы качества воды.

Лабораторная работа №7

БИОЛОГИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ АКТИВНОГО ИЛА

Цель работы ‑ ознакомление с биологическим методом анализа активного ила.

Биологический анализ активного ила имеет большое значение для оперативного контроля состояния процесса биологической очистки сточных вод. Простейшие индикаторные организмы хорошо реагируют на изменения условий существования: нагрузку на ил, обеспеченность кислородом, наличие токсичности, степень регенерации активного ила и т.п. Общее количество простейших и разнообразие видов меняются, кроме того, по сезонам года. В зимний период (температура воды 12-13⁰С) наблюдается наибольшее количество простейших при сравнительно небольшом их разнообразии (9-11 видов). Летом (температура воды 23-25⁰С) разнообразие видов наибольшее (свыше 15) при незначительном общем количестве простейших.

Пробы для анализа берут отдельно из каждого сооружения: аэротенка, регенератора, вторичного отстойника, биофильтра. Жидкую пробу, отобранную ковшом, переливают в широкогорлую банку, заполняют ее на половину объема и закрывают пробкой. Немедленно переносят в лабораторию и приступают к анализу не позднее чем через 20-30 мин с момента взятия пробы (в течение 1-2 ч пробу, не закрытую пробкой, можно хранить в холодильнике). Для отбора проб со дна сооружения из вторичного отстойника или из резервуара может быть применен батометр. Если его нет, используют склянку с пробкой, открывая ее на заданной глубине при помощи тросика, прикрепленного к пробке. Пробы с биофильтров отбирают скребком на разных глубинах загрузки. В лаборатории берут соскобы пленки с твердого субстрата и рассматривают под микроскопом. Тотчас после доставки проб из аэрационных сооружений в лабораторию отливают из каждой пробы 100 см³ в цилиндр для определения объема ила через 30 мин отстаивания и дозы ила.

Обычно для фиксации препаратов применяют 40%-й формалин. Можно использовать более сложные фиксаторы, например осмиевую кислоту, 1%-й водный раствор. Пары осмиевой кислоты очень ядовиты, поэтому для приготовления раствора вскрытую ампулу сразу бросают в склянку и доливают отмеренное количество дистиллированной воды. Хранят в темной склянке с хорошо притертой пробкой и притертым колпачком.

Основным методом анализа организмов активного ила (простейших, коловраток и др.) является микроскопирование в живом состоянии. В очищенной воде для сгущения пробы применяют центрифугирование, отстаивание или фильтрование через мембранный фильтр № 6 (размер пор 2-5 мкм). Каплю свежего ила наносят на стекло, покрывают покровным стеклом и просматривают под микроскопом. Рекомендуется просматривать до 10-15 капель.

Приборы, посуда, реактивы:

Микроскоп; предметные и покровные стекла; пипетка на 1 см³; активный ил (или настой сена 5-, 15-, 20-, 25-, 30-, 35-дневной выдержки в стаканах на 250 м); формалин 40%-й, вата; спирт.

Порядок выполнения работы

1. Получить у преподавателя образцы активного ила или его «макет». Удобным макетом является сенной настой разного срока выдержки с развивающимися в нем индикаторными видами. Технику приготовления сенного настоя см. в справочном материале к лабораторной работе. Использовать микроскоп с малым увеличением. На предметное стекло нанести пипеткой каплю предварительно хорошо перемешанной иловой смеси и накрыть покровным стеклом. Немедленно приступить к микроскопированию. Зарисовывать обнаруженные во всех полях зрения виды в рабочую тетрадь. На следующем этапе на предметное стекло нанести произвольное количество осевшего ила и зажать между двумя предметными стеклами. Здесь следует сосредоточить внимание на состоянии организмов, величине, форме и плотности хлопьев ила, наличии посторонних примесей.

2. Дать возможную характеристику активного ила по наличию индикаторных видов.

3. При статистической обработке полученные данные необходимо сравнить с отклонением от принятых норм, приведенных в табл. 14. Согласно приведенной в таблице классификации, средние значения даны для выборки по пробам с хорошим качеством очищенной воды, для которых прозрачность превышает 30 см. Если полученная характеристика не превышает m + 3δ, то возникшие патологические изменения в процессах биологической очистки нормализуются без дополнительного вмешательства оператора за счет самопроизвольного возврашения к режиму биологической очистки. Если характеристика превышает т + 7δ, то для восстановления нормальной работы необходимо вмешательство оператора

4. В тетради представить рисунки имеющихся групп организмов-индикаторов, сведения об их количественном учете, оценку степени очистки ила.

Таблица 14 – Критерии нормы и патологии индикаторных видов
активного ила

Биоиндикаторы	т	δ	т + 3δ	т + 7 δ
Zооglеа rаmigеrа
Нитчатые бактерии				14 561
Грибы
Водоросли
Мелкие Flаgеllаtа				3 521
Атоеbiпа			4 787	.9039
Jrотiа пеglecta			2 087	4 281
Цисты
Асtiпорoda
Сумма:
бентосных раковинных амеб			4 505
свободноплавающих инфузорий		-	-	-
прикрепленных инфузорий	1 087	-	-	-
коловраток		-	-	-

Вопросы для самоподготовки:

1. Что такое активный ил?

2. Дайте определение термину «аэротенк».

3. Назовите критерии отбора пробы.

4. Что используют в качестве фиксаторов пробы?

Лабораторная работа № 8