Тонкослойная хроматография

Приготовление растворов.

Раствор стандартного образца (СО) хлорогеновой кислоты. Около 0,020 г СО хлорогеновой кислоты растворяют в спирте 96 % в мерной колбе вместимостью 25 мл, доводят объем раствора спиртом 96 % до метки и перемешивают. Срок годности раствора 3 мес при хранении в хорошо укупоренной упаковке, в прохладном защищенном от света месте.

Дифенилборной кислоты 2 – аминоэтилового эфира раствор 1 % в спирте 96 %. 1,0 г дифенилборной кислоты 2-аминоэтилового эфира растворяют в 100 мл спирта 96 %. Срок годности 3 мес при хранении в прохладном, защищенном от света месте.

Раствор СО витамина K₁. Около 0,02 г СО витамина К₁ растворяют в гексане в мерной колбе вместимостью 25 мл, доводят объем раствора гексаном до метки и перемешивают. Срок годности раствора 30 сут при хранении в хорошо укупоренной упаковке, в прохладном защищенном от света месте.

1. Около 1,0 г сырья, измельченного до величины частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями размером 0,2 мм, помещают в плоскодонную коническую колбу вместимостью 50 мл, прибавляют 10 мл спирта 96 % и нагревают с обратным холодильником на водяной бане в течение 15 мин. Затем содержимое колбы охлаждают и фильтруют через бумажный фильтр. Полученный фильтрат высушивают под вакуумом при температуре 40 °С досуха. К сухому остатку прибавляют 2 мл спирта 96 % (испытуемый раствор).

На линию старта аналитической хроматографической пластинки со слоем силикагеля на алюминиевой подложке размером 10x10 см наносят 10 мкл испытуемого раствора и 5 мкл раствора СО хлорогеновой кислоты.

Пластинку с нанесенными пробами сушат на воздухе в течение 5-10 мин, помещают в камеру, предварительно насыщенную в течение 30 мин смесью растворителей муравьиная кислота безводная - метанол - этилацетат (2,5:4:50), и хроматографируют восходящим способом. Когда фронт растворителя пройдет около 80 - 90 % длины пластинки от линии старта, ее вынимают из камеры, сушат до удаления следов растворителей, нагревают в сушильном шкафу при 100 - 105 °С в течение 3-5 мин, обрабатывают дифенилборной кислоты аминоэтилового эфира раствором 1 % в спирте 96 %, и просматривают в УФ-свете при длине волны 365 нм.

На хроматограмме раствора СО хлорогеновой кислоты должна обнаруживаться зона адсорбции с интенсивной сине-голубой флуоресценцией.

На хроматограмме испытуемого раствора должны обнаруживаться зона адсорбции с интенсивной сине-голубой флуоресценцией на уровне зоны на хроматограмме растворов СО хлорогеновой кислоты и зона адсорбции с интенсивной синей флуоресценцией выше зоны хлорогеновой кислоты; допускается обнаружение других зон адсорбции.

2. Около 1,0 г сырья, измельченного до величины частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями размером 0,25 мм, помещают в плоскодонную коническую колбу вместимостью 50 мл, прибавляют 10 мл гексана и перемешивают на механическом встряхивателе в течение 3 ч. Затем фильтруют через бумажный фильтр, отгоняют растворитель на ротационном испарителе при температуре водяной бани не выше 45 °С до объема 2 3 мл (испытуемый раствор).

На линию старта аналитической хроматографической пластинки со слоем силикагеля с флуоресцентным индикатором на алюминиевой подложке размером 10x15 см наносят 100 мкл испытуемого раствора и 10 мкл раствора СО витамина К₁.

Пластинку с нанесенными пробами сушат на воздухе при комнатной температуре в течение 5-10 мин, помещают в камеру, предварительно насыщенную в течение 30 мин верхним слоем смеси растворителей гексан - хлороформ (8:3), и хроматографируют восходящим способом. Когда фронт растворителей пройдет около 80 - 90 % длины пластинки от линии старта, ее вынимают из камеры, сушат до удаления следов растворителей и просматривают в УФ-свете при длине волны 365 нм в течение не менее 2

мин.

На хроматограмме раствора СО витамина K₁ должна обнаруживаться зона адсорбции с флуоресценцией желто-зеленого цвета.

На хроматограмме испытуемого раствора должна обнаруживаться основная зона адсорбции с флуоресценцией желто-зеленого цвета на уровне зоны адсорбции витамина K₁; допускается обнаружение других зон адсорбции.

ИСПЫТАНИЯ

Влажность. Цельное сырье, измельченное сырье, порошок - не более 14%.

Зола общая. Цельное сырье, измельченное сырье, порошок - не более 20%.

Зола, нерастворимая в хлористоводородной кислоте. Цельное сырье, измельченное сырье, порошок - не более 2 %.

Измельченность сырья. Цельное сырье: частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями размером 3 мм, - не более 5 %. Измельченное сырье: частиц, не проходящих сквозь сито с отверстиями размером 7 мм, не более 5 %; частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями размером 0,18 мм, - не более 5 %. Порошок: частиц, не проходящих сквозь сито с отверстиями размером 2 мм, — не более 5 %; частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями размером 0,18 мм, — не более 5 %.

Посторонние примеси

Сырье, изменившее окраску (потемневшее и почерневшее). Цельное сырье, измельченное сырье - не более 5 %.

Другие части растения (стебли, соцветия и пр.). Цельное сырье, измельченное сырье - не более 5 %.

Органическая примесь. Цельное сырье, измельченное сырье — не более 2%.

Минеральная примесь. Цельное сырье, измельченное сырье, порошок - не более 1 %.

Тяжелые металлы. В соответствии с требованиями ОФС «Определение содержания тяжелых металлов и мышьяка в лекарственном растительном сырье и лекарственных растительных препаратах».

Радионуклиды. В соответствии с требованиями ОФС «Определение содержания радионуклидов в лекарственном растительном сырье и лекарственных растительных препаратах».

Остаточные количества пестицидов. В соответствии с требованиями ОФС «Определение содержания остаточных пестицидов в лекарственном растительном сырье и лекарственных растительных препаратах».

Микробиологическая чистота. В соответствии с требованиями ОФС «Микробиологическая чистота».

Количественное определение. Цельное сырье, измельченное сырье, порошок: сумма оксикоричных кислот в пересчете на хлорогеновую кислоту - не менее 0,3 %.

Аналитическую пробу сырья измельчают до величины частиц, проходящих через сито с отверстиями размером 1 мм. Около 0,5 г (точная навеска) измельченного сырья помещают в круглодонную колбу со шлифом вместимостью 250 мл, прибавляют 50 мл спирта 70 %. Колбу с содержимым присоединяют к обратному холодильнику и нагревают на кипящей водяной бане в течение 30 мин, периодически встряхивая для смывания частиц сырья со стенок. После охлаждения извлечение фильтруют через бумажный фильтр в мерную колбу вместимостью 100 мл. Экстрагирование повторяют еще раз в описанных выше условиях. Полученное извлечение фильтруют в ту же мерную колбу. Объединенные извлечения в мерной колбе доводят спиртом 70 % до метки и перемешивают (раствор А).

2,0 мл раствора А переносят в мерную колбу вместимостью 25 мл, доводят объем раствора спиртом 96 % до метки и перемешивают (раствор Б). Оптическую плотность раствора Б измеряют на спектрофотометре при длине волны 330 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. В качестве раствора сравнения используют спирт 96 %.

Содержание суммы оксикоричных кислот в пересчете на хлорогеновую

кислоту в абсолютно сухом сырье в процентах (X) вычисляют по формуле:

где А - оптическая плотность раствора Б;

— удельный показатель поглощения хлорогеновой кислоты при длине волны 330 нм. равный 507;

а - навеска сырья, г;

W - влажность сырья, %.

Упаковка, маркировка и транспортирование. В соответствии с требованиями ОФС «Упаковка, маркировка и транспортирование лекарственного растительного сырья и лекарственных растительных препаратов».

Хранение. В соответствии с требованиями ОФС «Хранение лекарственного растительного сырья и лекарственных растительных препаратов».