Раздел: « физиология микробов »
Занятие 5. Дата ______. Тема: «Принципы культивирования бактерий. Выделение и идентификация чистых культур бактерий. Культивирование анаэробов»
Таблица 3.Классификация питательных сред
| Группа питательных сред | Жидкие | Плотные |
| Основные (простые) | ||
| Простые среды | Мясо-пептонный бульон (МПБ) | Мясо-пептонный агар (МПА) |
| Специальные (сложные) | ||
| А. Сложные специальные | ¨ Сахарный МПБ для стрептококков и др. | ¨ Сахарный МПА ¨ 5% кровяной агар и др. |
| Б. Элективныеилиизбирательные (преимущественно растет определенный вид микроорганизмов, другие не растут или растут плохо) | ¨ 1% щелочная пептонная вода для холерного вибриона ¨ 10% желчный бульон для сальмонелл и др. | ¨ Желточно-солевой агар (ЖСА) для стафилококков ¨ Свернутая сыворотка для дифтерийной палочки ¨ Кровяной агар с ванкомицином для бактероидов и др. |
| В. Среды обогащения(всегда жидкие; используются для накопления микробов определенного вида. Рост сопутствующей микрофлоры подавляется ингибиторами) | ¨ Селенитовый бульон для дизентерийной палочки ¨ 10% желчный бульон для сальмонелл и др. | ________ |
| Г. Дифференциально-диагностические (применяются для первичной дифференциации бактерий преимущественно по биохимическим свойствам, а также для идентификации бактерий) | ¨ Среды Гисса (“пестрый ряд” для определения сахаролитической активности бактерий) | ¨ Среда Эндо ¨ Среда Левина ¨ Среда Плоскирева ¨ Среды Гисса (полужидкие) и др. |
| Д. Хромогенные (всегда плотные; применяются для дифференциации бактерий по культуральным свойствам) | ________ | ¨ «УриселектТМ » и др. |
| Е. Транспортные (для доставки исследуемого материала в лабораторию) | ¨ Среда Стюарта и др. | ¨ Среда Стюарта (полужидкая) и др. |
| Синтетические | ||
| -------- | ¨ Среда Сотона |
Протокол “ВЫДЕЛЕНИЕ И ИДЕНТИФИКАЦИЯ ЧИСТЫХ КУЛЬТУР БАКТЕРИЙ”
1 ЭТАП. Посев исследуемого материалана чашки Петри с плотной питательной средой (МПА) методом штриха.
Инкубация при37оС в течение 24 часов.
Примечание 1: в том случае, если в исследуемом материале содержится незначительное количество возбудителя, то его предварительно накапливают путем посева материала в жидкую питательную среду (см. среды обогащения), а затем после инкубации при 37оС производят пересев на плотную среду.
Примечание 2: выделение и идентификацию чистой культуры анаэробов производится в анаэробных условиях.
2 ЭТАП. Идентификация выделенной чистой культуры(чистых культур)по культуральным, морфологическим и тинкториальным свойствам.Для этого проводят:
а) макро- и микроскопическое исследование колоний, выросших на плотной питательной среде(культуральные свойства);
б) приготовление мазка из половины колонии каждого вида и окраску препарата по Граму (морфологические и тинкториальные свойства);
Примечание: микроскопия материала из колоний производится также с целью проверки чистоты культуры.
в) пересев оставшейся части колонии на скошенный агар для накопления выделенной чистой культуры.
Инкубация при37оС в течение 24 часов.
Таблица 4.Схема описания колоний
| № | Размеры | Форма | Цвет | Поверхность | Края | Консистенция | Структура | Морфология; Окраска по Граму | Предполагаемый возбудитель |
ЭТАП. А. Идентификация выделенной чистой культуры бактерий по биохимическим и антигенным свойствам.
Для этого производят следующие исследования:
а) изучение однородности роста на скошенном МПА;
б) приготовление, окраска мазка по Граму (или фуксином) и микроскопия для проверки чистоты выделенной на скошенном МПА культуры;
в) изучение биохимической активности бактерий:посев выделенной чистой культуры на среды Гисса (для определения сахаролитической активности), желатини МПБ с индикаторными бумажками на индол, аммиакисероводород(для выявления протеолитической активности).Инкубация при 37оС в течение 24 часов.
Примечание: изучение биохимических свойств проводят только при работе с чистой культурой бактерий. При этом определяют свойства каждого выделенного микроорганизма в отдельности. Если при микроскопии мазка из материала со скошенного МПА обнаруживается смесь бактерий, то процедуру выделения чистой культуры бактерий необходимо повторить.
Таблица 5.Ферментативные свойства бактерий
| Предполагаемый возбудитель | САХАРОЛИТИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА | ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА | ||||
| Глюкоза | Лактоза | Маннит | Сахароза | Индол | Сероводород | |
| Escherichia coli | ||||||
| Staphylococcus aureus |
г) изучение антигенных свойств выделенных бактерий (будет проводиться в разделе:”ИНФЕКЦИЯ И ИММУНИТЕТ”).
Б. Определение чувствительности бактерий к антибиотикамметодом дисков. Инкубация при37оС в течение 24 часов.
В. Внутривидовая идентификация выделенной чистой культуры бактерий(эпидемиологическое маркирование). Проводится часто с целью определения источника инфекции. С этой целью применяют фаготипирование, рестрикционный анализ, определение плазмидного профиля бактерий и др. исследования.