Определение токсичности почв по отношению к микроорганизмам
Метод определения степени токсичности почв к микроорганизмам используется в качестве быстрого и достаточно чувствительного теста для получения ориентировочных данных о способности почвы самоочищаться от патогенных и санитарно-показательных микроорганизмов. Кроме того, этот тест оказался также чувствительным при определении влияния химических веществ на почвенный микробиоценоз. Низкая степень токсичности или ее снижение по отношению к патогенным микроорганизмам свидетельствует о наличии или возникновении более благоприятных условий для выживания возбудителей в таких почвах. Это явление неблагоприятное по классам:
1 - отсутствие - 0 - 20% токсичных образцов,
2 - слабо выраженная - 21 - 40% токсичных образцов,
3 - средняя - 41 - 60% токсичных образцов,
4 - сильно выраженная - 61 - 80% токсичных образцов,
5 - абсолютная - 81 - 100% токсичных образцов.
Для определения токсичности почв можно использовать два метода - качественный и качественно-количественный.
Качественный метод определения токсичности почв
В стерильную чашку Петри вносится 10 г перемешанной и просеянной почвы и ровным слоем распределяется на половину дна чашки. На дне и крышке чашки записывается номер пробы по журналу и тест-микроорганизм. Затем чашки переносят в бокс и устанавливают на ровной поверхности. Чашки с почвой заливают 1,5%-ным непитательным агаром в количестве около 10,0 см3 с таким расчетом, чтобы он покрыл слой почвы. После его застывания в чашки вносится питательный агар также в количестве 10 см3, адекватный тест-микроорганизмам. Из одного почвенного образца готовятся 2 параллельные чашки к каждому микроорганизму. Чашки высушивают под бактерицидными лампами в течение 30 минут. Затем производится посев индикаторных штаммов микроорганизмов.
Посевы производятся петлей, причем движения петли всегда начинают с той части чашки, на которой помещена почва. В качестве контроля производят посевы тех же культур на аналогичные среды, но без почвы.
Посевы инкубируют в зависимости от вида индикаторного микроорганизма. Учет результатов начинается с просмотра контрольного посева. В случае равномерного роста тест-микроба на всей поверхности агаровой пластинки просматривают остальные чашки с посевами. Колонии идентифицируются по "форме роста". Кроме того, из каждой серии посевов с нескольких чашек снимают колонии и производят их идентификацию.
Рост колоний только на участке агаровой пластинки, под которой нет почвы, показывает, что исследованный почвенный образец токсичен (Т). При исследовании некоторых почвенных проб отмечается частичное ингибирование роста тест-микроба. В этих случаях регистрируется маловыраженная токсичность (М/Т).
Качественно-количественный метод определения токсичности почв
В стерильную чашку Петри также вносится 10 г почвы и распределяется равномерно по всей поверхности, затем, как и при качественном методе, вносится непитательный и питательный агар. В качестве дополнительного барьера между почвой и индикаторным штаммом на поверхности питательной среды укладывают мембранный фильтр.
На матовую поверхность мембранных фильтров простым карандашом наносятся 16 точек, после чего фильтр стерилизуют кипячением. Затем на питательную среду помещают мембранные фильтры (матовой поверхностью вверх) в количестве от 1 до 4-х на одну чашку. На поверхность фильтра в местах, отмеченных точками, производят посев бактериальной петлей (иглой) культуры индикаторного штамма, суспензированного в физиологическом растворе, содержащем около 100 млн. бактериальных клеток в 1 мл по оптическому стандарту мутности. Эта манипуляция упрощается при использовании специального штампа в виде металлического диска диаметром около 30 мм. В диск вмонтированы 16 стальных игл строго одинаковой длины и толщины. Культуры микроорганизмов наливают в чашки Петри и погружают в них кончики игл стерильного штампа, а затем одновременно производится посев в 16 точках мембранного фильтра. Посевы инкубируют в термостате или анаэростате при оптимальной температуре и продолжительности в зависимости от физиологических особенностей индикаторного штамма.
Учет результатов производят путем подсчета выросших колоний в точках посева. Процент пророста (Р) высчитывается как количество образовавшихся колоний к количеству посевов. Токсичность определяется по формуле: Т = 100 - Р. Этим методом, как и качественным, устанавливается абсолютная токсичность, когда на фильтрах не вырастает ни одна колония; отсутствие токсичности - на метах всех посевов вырастают колонии и различная степень токсичности - когда прорастает только часть засеянных точек.