Фазовоконтрастная микроскопия

Обыкновенные окрашенные препараты поглощают часть проходящего через них света, в результате чего амплитуда световых волн снижается и частицы препарата выглядят темнее фона. При прохождении света через неокрашенный препарат амплитуда световых волн не меняется, происходит лишь изменение фазы световых волн, прошедших через час­тицы препарата. Однако человеческий глаз улавливать это изменение фазы света неспособен, поэтому неокрашенный препарат при правильной установке освещения в микроскопе будет невидим.

Фазоконтрастное устройство позволяет превратить изменение фазы лучей, прошедших через частицы неокрашенного препарата, в изме­нения амплитуды, воспринимаемые человеческим глазом и, таким образом, позволяет сделать отчетливо видимыми неокрашенные препараты.

Приспособление для фазовоконтрастной микроскопии включает в себя конденсор с набором кольцевых диафрагм, обеспечивающих осве­щение препарата полным конусом света, и фазовоконтрастные объекти­вы, которые отличаются от обычных тем, что в их главном фокусе располагается полупрозрачная фазовая пластинка в виде кольца, вызы­вающая сдвиг фазы проходящего через нее света. Установка освещения производится таким образом, чтобы весь свет, прошедший через коль­цевидную диафрагму конденсора, прошел в дальнейшем через расположенное в объективе фазовое кольцо.

При рассмотрении препарата весь свет, прошедший через участки препарата, в которых нет каких-либо объектов, пройдет через фазовое кольцо и даст светлое изображение фона. Свет, прошедший через имеющиеся в препарате частицы, например, бактериальные клетки,получит некоторые изменение фазы и, кроме того, разделится на два луча - недифрагированный и дифрагированный. Недифрагированный свет пройдет в дальнейшем через кольцевидную фазовую пластинку в объекти­ве и получит дополнительный сдвиг фазы. Дифрагированные лучи пройдут мимо фазовой пластинки, и их фаза не изменится. В плоскости полевой диафрагмы окуляра произойдет интерференция дифрагированного и недифрагированного лучей. Так как эти лучи идут в разных фазах, произойдет их взаимное частичное гашение и уменьшение амплитуды. Благодаря этому микробные клетки будут выглядеть на светлом фоне темными.

Техника фазовоконтрастной микроскопии. Фазовый кон­денсор вставляют в микроскоп на место обычного, а в револьвер ввинчивают фазовые объективы. Диск револьвера конденсора повора­чивают таким образом, чтобы в его окне появилась цифра "О".

Осветитель ставят на планку, соединяющую его с микроскопом. На поверхность плоского зеркала кладут белую бумагу и патрон осве­тителя вдвигают или выдвигают таким образом, чтобы на бумаге поя­вилось четкое изображение спирали лампы осветителя. Убирают бума­гу, закрывают диафрагму конденсора и поворачивают зеркало так, чтобы изображение нити лампы проецировалось на эту диафрагму, после чего полностью открывают диафрагму конденсора.

На столик микроскопа ставят препарат и фокусируют на него слабый сухой объектив. Не трогая наводки микроскопа, поднимают или опускают конденсор, чтобы получить резкое изображение диафрагмы осветителя в поле зрения микроскопа. Вращением зеркала приводят изображение диафрагмы осветителя в центр поля зрения микроскопа и максимально суживают диафрагму осветителя.

Наводят на препарат фазовый объектив, с которым желают работать. Подниманием или опусканием конденсора добиваются наиболее резкого изображения диафрагмы осветителя, а вращением зеркала уточняют ее центрировку по отношению к краям поля зрения. После этого открывают диафрагму осветителя так, чтобы ее изображение вышло за пределы поля зрения.

Вместо окуляра вставляют в тубус микроскопа вспомогательный микроскоп. Выдвигая трубку вспомогательного микроскопа, добиваются четкой видимости фазового кольца объектива и закрепляют фокусировку вспомогательного микроскопа боковым винтом.

Не трогая макро- и микровинта микроскопа, поворачивают револьвер конденсора так, чтобы в его окошке появилась цифра, соответствующая увеличению применяемого объектива. При этом во вспомогательном микроскопе становятся видны два кольца - темное фазовое кольцо объектива и светлое кольцо диафрагмы конденсора. С помощью центрировочных винтов, расположенных по бокам конденсора, добиваются полного наложения друг на друга этих двух колец. Затем выни­мают из тубуса вспомогательный микроскоп, вставляют на его место окуляр и приступают к наблюдению препарата. При работе с фазовоконтрастным микроскопом под конденсором рекомендуется помещать зеленый светофильтр, значительно улучшающий качество изображения.

Б. Морфология микроорганизмов

§ I. Приготовить препараты-мазки из культур: а) стафилококка, стрептококка, сарцины (кокковые формы); б) монобактерии, стрептобациллы (палочковидные формы); в) вибриона (извитая форма) Окрасить их фуксином Пфейффера, промикроскопировать и зарисовать. Обратить внимание на форму и взаиморасположение бактерий в каждом препарате.

§ 2. Посмотреть под микроскопом препарат-мазок из культуры бактерий, имеющих жгутики, и зарисовать. Препарат окрашен по мето­ду Бениньетти.

§ 3. На хорошо обезжиренное покровное стекло нанести петлей небольшую каплю водопроводной воды, с помощью бактериологической петли внести в нее незначительное количество исследуемой культуры ("облачко помутнения") и размешать ее, не размазывая капли.

Взять предметное стекло с углублением и края углубления сма­зать тонким слоем вазелина. Перевернув предметное стекло углубле­нием вниз, наложить его на покровное стекло так, чтобы капля соответствовала средине углубления, и слегка прижать одно стекло к другому. Быстро перевернуть полученную влажную камеру покровным стеклом вверх и с помощью рукоятки петли прижать края покровного стекла, чтобы получить герметически замкнутую камеру. Капля должна висеть в камере, не сливаясь с ее дном.

Помещают препарат "висячая капля" на предметный столик микроскопа покровным стеклом вверх. Опустив конденсор, устанавливают слабый объектив и отыскивают край капли. Устанавливают край капли точно в центре поля зрения и закрепляют препарат клеммами.

Приподняв тубус, поворотом револьвера ставят сильный сухой объектив (40Х). Глядя сбоку, опускают объектив на расстояние, меньшее свободного рабочего (почти вплотную к покровному стеклу). Глядя в окуляр и уменьшив освещение диафрагмированием или опусканием конденсора, с помощью макровинта медленно поднимают тубус до тех пор, пока не удастся увидеть край капли. Если с первого раза это

Рис.4 Стафилококк

Рис.5 Стрептококк

Рис.6 Сарцина

Рис.7 Монобактерии

Рис.8 Стрептобацилла

Рис.9 Вибрион

Рис.10 Жгутики бактерий окраска по Бениньетти

Рис.11 Препарат “висячая капля”

Рис.12 Рост бактерий на среде Пешкова 1-подвижные бактерии; 2-неподвижные бактерии

не удается, ни в коем случае не следует опускать тубус, глядя в окуляр (можно раздавить покровное стекло), следует повторить всю установку сначала.

Установив в фокусе край капли, сдвигают его несколько в сторону, не теряя из поля зрения, и рассматривают подвижность бактерий. Препарат зарисовать.