Работа №35 Цитохимический метод определения миелопероксидазы (МП) нейтрофилов
Принцип. В присутствии МП бензидин окисляется перекисью водорода в коричневый оксибензидин. Фермент локализуется в специфической зернистости цитоплазмы гранулоцитов и является маркером клеток миелоидной природы. Роль фермента заключается в том, что он разрушает токсическую перекись водорода, образующуюся в процессе жизнедеятельности клеток.
Реактивы:
1) Формалин 4% спиртовой раствор /10 частей 40% формалина и 90 частей спирта/;
2) Реакционная смесь: бензидин 0,5 г (на кончике ножа) растворяют при встряхивании в 100 мл дистил. воды и добавляют 0,3 мл 3% раствора перекиси водорода. Реактив годен в течении 5-6 дней;
3) Метиленовый зеленый 0,5 % раствор.
Ход определения:
Мазки крови высушивают на воздухе и фиксируют в растворе формалина 1-2 мин. Затем промывают водой. Фиксированные мазки выдерживают в течение 10 минут в реакционной смеси. Быстро докрашивают 0,5% метиленовым зеленым (или метиленовым синим) -2 мин.
Активность фермента выявляется в клетках гранулоцитов в виде желто-коричневых гранул (зерен), которые определяют при микроскопии с иммерсией.
Оценка:
+ /слабо положительная реакция/ - это 1-2 зернышка или небольшое окрашивание цитоплазмы.
++ / положительная реакция/ - зерна на 1/3 цитоплазмы.
+++ /интенсивная реакция/ - зерна на 1/2 - 2/3 цитоплазмы.
++++ /резко положительная реакция/ - зерна на всю цитоплазму.
Расчет по формуле СЦК/средний цитохимический коэффициент/:
4а+Зб+2в+1г+Од
СЦК= —————————,где
цифры - степень активности МП;
буквы - число клеток с той или иной активностью;
100 — общее число подсчитанных нейтрофилов.
Нормы: СЦК 2,56 ±0.03.
Клинико-диагностическое значение
Активность миелопероксидазы в нейтрофилах снижена при инфаркте миокарда, обострении ревматизма, туберкулезе, опухолях. У больных с хроническим миелолейкозом, особенно в терминальной стадии, СЦК снижается до 1,65± 0,2 ед. В бластных клетках активность ферментов высокая при остром миелобластном лейкозе, слабая - при остром монобластном и отсутствует - при остром лимфобластном лейкозе.
Задания для контроля
1. Что называют активным центром ферментов? Перечислите этапы микрогетерогенного катализа в оганизме человека. Пути регуляции активности ферментов.
2. Что выражает уравнение Михаэлиса-Ментен? Анализ его.
3. Перечислите классы ферментов по типу катализируемой реакции и сложности строения молекулы фермента. Приведите соответствующие примеры.
4. Что называют изоферментами? Значение определения изоферментов в определении локализации патологического процесса в организме человека.
5. Перечислите ферменты, используемые в энзимодиагностике.
6. Перечислите ферменты, используемые в энзимотерапии.
7. Что называют энзимопатиями? Приведите примеры.
8. Какие условия рекомендуется соблюдать приколичественном измерении ферментов?
9. При каких условиях достигается скорость ферментативной реакции?
10. Назовите нормальные показатели ферментов (АсТ, АлТ; ЛДГ; ЩФ; КФ; КК; ХЭ; L – амилазы; МП) в сыворотке крови.
11. Какого КДЗ ферментов (АсТ, АлТ; ЛДГ; ЩФ; КФ; КК; ХЭ; L – амилазы; МП)?
Приложение 1
Список условных сокращений
| a-КГ | - a-кетоглутаровая кислота |
| АВР | - активированное время рекальцификации плазмы |
| АДФ | - аденозиндифосфорная кислота |
| АК | - аминокислоты |
| АКТГ | - адренокортикотропный гормон |
| АлАТ | - аланинаминотрансфераза |
| АМФ | - аденозинмонофосфорная кислота |
| АсАТ | - аспартатаминотрансфераза |
| АТФ | - аденозинтрифосфорная кислота |
| АЧТВ | - активированное частичное тромбопластиновое время |
| ВЕ | - щелочные резервы |
| ВЖК | - высшие жирные кислоты |
| ГГФРТ | - гипоксантингуанинфосфорибозилтрансфераза |
| ГТТ | - глюкозотолерантный тест |
| ГТФ | - гуаназинтрифосфорная кислота |
| ДВС | - диссемированное внутрисосудистое свертывание крови |
| ДНК | - дезоксирибонуклеиновая кислота |
| ЖКТ | - желудочно-кишечный тракт |
| ИЭТ | - изоэлектрическая точка белка |
| КОС | - кислотно-основное состояние |
| КФК | - креатинфосфокиназа |
| ЛВП | - липопротеины высокой плотности |
| ЛГ | - лютеинизирующий гормон |
| ЛДГ | - лактатдегидрогеназа |
| ЛНП | - липопротеины низкой плотности |
| ЛОНП | - липопротеины очень низкой плотности |
| ЛХАТ | - лецитинхолестринацилтрансфераза |
| НАДН+Н+ | - никотинамиддинуклеотид восстановленный |
| НАДФН+Н+ | - никотинамиддинуклеотидфосфат восстановленный |
| НК | - нуклеиновые кислоты |
| ОАА | - оксалоацетат |
| ПВК | - пировиноградная кислота |
| ПДФ | - продукты деградации фибрина и фибриногена |
| ПОЛ | - перекисное окисление липидов |
| рН | - водородный показатель |
| РНК | - рибонуклеиновая кислота |
| рО2 | - парциальное давление кислорода |
| рСО2 | - парциальное давление углекислого газа |
| СИ | - Международная система единиц измерения |
| СМ | - средние молекулы |
| СРБ | - С-реактивный белок |
| СФ | - спектрофотометр |
| ТАГ | - триацилглицерины |
| УТФ | - урединтрифосфорная кислота |
| ФАД | - флавинадениндинуклеотид |
| ФАК | - фибринолитическая активность крови |
| ФЛ | - фосфолипиды |
| ФМН | - флавинмононуклеотид |
| ФСГ | - фолликулостимулирующий гормон |
| ФЭК | - фотоэлектроколориметр |
| ХМ | - хиломикроны |
| ХС | - холестерин |
| ЦНС | - центральная нервная система |
| ЦПЭ | - цепь переноса электронов |
| ЦТК | - цикл трикарбоновых кислот |
| ЭХС | - эфиры холестерина |
Приложение 2