Регуляторные гены и белки

tat - pI4 (TAT); vif - р23 (VIF);

rev - pI2 (REV); vpu - pI6 (VPU);

nef - p27 (NEF); vpr - (VPR).

Таким образом, девять генов вируса кодируют синтез 14 белков. Это связано с тем, что некоторые гены имеют экзонно-интронную структуру и имеют несколько рамок считывания.

Схематическое расположение генов вируса можно изобразить следующим образом:

5`-LTR-gag-pol-vif-tat-rev-env-nef-vpu-vpr-3`-LTR

Сложность работы генома вируса связана с наличием в LTR спе­циальных регуляторных элементов:

а)сигнал транскрипции;

б)сигнал добавления поли-А,

в)сигнал интеграции

г)элемент позитивной регуляции (TAR)

д)элемент негативной регуляции (NRE)

е)область промотора (ТАТАА).

Кроме того, обнаружены элементы, участвующие в регуляции сплайсинга РНК (CRS - стимулирует сплайсинг) и CAR (ингибирует сплайсинг при наличии белка REV ), и элемент Psi , который контро­лирует упаковку геномной РНК в капсид. В LTR имеются элементы, ко­торые определяют участок прикрепления затравочной РНК (тРНК л из ) для синтеза минус-цепи ДНК и участок, служащий затравкой для синтеза плюс-цепи ДНК.

В регуляции вируса особенно важную роль играют белки ТАТ (позитивный контроль размножения вируса через участок TAR), и NEF и VPU-негативный контроль репродукции вируса (через участок NRE) и белок REV (позитивно-негативный контроль через участок CAR). Белок REV контролирует экспрессию генов gag pol env и осуществляет негатив­ную регуляцию сплайсинга.

Таким образом, размножение вируса СПИДа находится под сложным тройным контролем - позитивным, негативным и позитивно-негативным .

§ 2. Взаимодействие вируса с клеткой протекает по следующей схеме: - адсорбция вируса - окаймленная ямка - окаймленный пузырек-лизосома - слияние мембран - выход нуклеокапсида в цитоплазму -син­тез обратной транскриптазой минус-цепи ДНК - разрушение РНК-азой Н вирионной РНК - синтез ДНК-полимеразой плюс-цепи ДНК-образование LTR-проникновение ДНК-провируса в ядро (в хромосому с помощью интегразы). Активация вируса-синтез полноразмерных и субгеномных РНК клеточной РНК-полимеразой - протеолиз и процессинг env- белков -синтез других белков - ассоциация двух молекул геномной РНК с кап-сидными белками - включение двух молекул РНК (а также двух молекул затравочной тРНК и pol- белков) в капсид - мембрана клетки - липидная оболочка - белки gp4I и gpI20 - отпочкование вирионов - образо­вание симпластов из Т-лимфоцитов - их гибель - иммунодефицит - нарушение других систем - присоединение оппортунистических инфекций.

Заражение вирусом - начало вирусоносительства. Активация Т-лимфоцита (и, соответственно, вируса) - начало болезни.

§ 3. Вирусологический диагноз ВИЧ-инфекции трудно осуществим, так как животные к вирусу не чувствительны, а вирус размножается только в одном клоне лимфоцитов (Н9), которых лаборатории не имеют. Наличие вируса или его антигенов можно обнаружить с помощью некоторых иммунологических реакций, но для этого требуются специфические антитела, получение которых связано с большими трудностями. В принципе, возможно использование также метода РНК-зонда.

4. Основным способом диагностики ВИЧ-инфекции и особенно выявления вирусоносительства является использование метода иммуноферментного анализа. Имеющиеся коммерческие тест-системы просты в употреблении, содержат сенсибилизированные антигеном лунки в планшетах, все необходимые ингредиенты и контроли. В силу своей универсальности этот метод получил повсеместное применение. Демонстрация отечественных тест-систем для иммуноферментного определения антител к вирусу СПИДа. Постановка опыта (методика опыта описана в занятии 11).

§ 5. Недостатком иммуноферментного метода является то, что нередко он дает ложнопозитивные результаты. Поэтому в случае сомнения такая сыворотка подвергается контрольному испытанию более чувствительными специфичными методами, например с помощью метода иммуноблотинга или иммунопреципитации.

Метод иммуноблотинга представляет собой тестирование твердо-фазным иммунологическим анализом электрофоретически разделенных белков. Реакция ставится в следующей последовательности: электрофоретическое разделение анализируемого материала на индивидуальные белки или полипептиды в геле; получение реплики путем переноса исследуемых белков с геля на твердофазный матрикс; блокирование незанятых центров связывания белков матрикса; инкубирование со специфической тест-сывороткой; отмывка от избытка сыворотки; инкубирование с меченым иммунореагентом на антитела специфической сыворотки; отмывка от избытка меченого иммунореагента; выявление тестируемых белков или полипептидов с помощью метки иммунореагента.

Для разделения анализируемого материала используют чаще всего различные варианты электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ).

После электрофоретического разделения белков их иммобилизуют на твердой фазе (матриксе), в качестве которой в основном применяют нитроцеллюлозные мембраны (НЦМ). На ПААГ помещают НЦМ и проводят электрофоретический перенос в перпендикулярном к гелю направлении.

На полученной нитроцеллюлозной реплике блокируют активные центры связывания во избежание неспецифической адсорбции реагентов. С этой целью НЦМ инкубируют с раствором бычьего сывороточного альбумина в концентрации 2-5% в течение 1-2 часов.

После блокирования активных мест связывания НЦМ инкубируют с эмпирически подобранным разведением специфической сыворотки (т.е. заведомо положительной сывороткой), причем время инкубирования изменяется в широком диапазоне в зависимости от авидности компонентов. Обычно инкубирование в течение двух часов при 37° или в течение ночи при 4° дает хорошие результаты. НЦМ несколько раз отмывают блокирующим раствором от неспецифически адсорбированной сыворотки и тестируют специфические антитела одним из методов твердофазного иммунного анализа, чаще всего используют ИФМ или РИМ. В том и другом случае НЦМ после обработки специфической сывороткой инкубируют с меченными ферментом антивидовыми антителами, в качестве метки используют пероксидазу хрена (ИФМ) либо радиоактивный йод (РИМ).

После отмывки физиологическим буфером избытка меченых антител на заключительном этапе проведения иммуноблотинга выявляют тестируемые антитела по ферментативной реакции с соответствующим субстратом или авторадиографическим методом.

Контрольные вопросы по вирусологии

Что собой представляют вирусы, являются ли они живыми существами или неживыми структурами?

Каким образом происходит проникновение вируса в клетку?

Какие вакцины применяют для профилактики гриппа? Чем отличаются вирусы от всех прочих живых существ?

Рис.1 СХЕМА СТРОЕНИЯ ВИРИОНА ВИРУСА СПИДа

Каким способом происходит заражение вирусом гепатита В? Какие формы вирусных гепатитов Вы знаете?

С какой целью производится фаготипирование бактерий, например, стафилококков?

Какие методы культивирования вирусов Вы знаете и какие методы их типирования применяются?

Что собой, представляют аденовирусы и какие наиболее характерные признаки проявления аденовирусной инфекции?

Какие вирусы являются возбудителями острых респираторных заболе­ваний (ОРЗ)?

Каким образом происходит заражение человека вирусом иммунодефицита?

По каким признакам можно судить о размножении вирусов в культуре клеток?

Какие клетки организма поражает вирус иммунодефицита и какой рецептор имеют эти клетки?

В чем заключается сущность иммуноферментного метода (ИФМ) диагностики инфекционных заболевании?

Сколько типов вирусов гепатита Вы знаете?

Какие серологические реакции применяются для диагностики гриппа?

Какие серологические реакции можно использовать для диагностики вирусных инфекций?

Какие вирусы вызывают острые кишечные заболевания (ОКЗ)?

Из каких основных этапов складывается процесс взаимодействия вируса с клеткой?

Какие типы вирусных геномов Вы знаете?

Чем характеризуются арбовирусы? Какие типы флавивирусов вызывает клещевой весенне-летний энцефалит и омскую геморрагическую лихорадку?

Каковы методы микробиологической диагностики клещевого энцефалита?

Из каких структурных компонентов состоят вирусы? Что такое капсид? Нуклеокапсид? Какие типы их симметрии Вы знаете?

Изменение каких наружных белков вируса гриппа приводит к появлению пандемических вариантов его и почему?

Как устроен вирус гриппа? Каковы особенности его генома?

Какая вакцина применяется в нашей стране для создания активного коллективного иммунитета против полиомиелита?

В каком возрасте делают прививки против полиомиелита?

Каким образом можно выделить от больного гриппом возбудителя и установить его серотип?

Как устроен вирус полиомиелита и каковы способы заражения этим возбудителем?

Как устроен вирус иммунодефицита человека?

Сколько генов имеет вирус иммунодефицита и какие белки они контролируют?

Какие регуляторные элементы содержатся в длинных концевых повторах (LTR) генома вируса иммунодефицита?

Каков механизм развития иммунодефицита человека в результате заражения его возбудителем?

Какие методы применяются для диагностики вирусного гепатита А?

Какая иммунологическая реакция применяется для обнаружения поверхностного антигена (HBsAg) вируса гепатита В у больных и вирусоносителей?

Какие вакцины используются для создания активного коллективного иммунитета против гепатита В?

Что собой представляет возбудитель дельта-гепатита?

Чем характеризуется возбудитель гепатит А?

Как устроен вирус - возбудитель гепатита В? Какую роль играет содержащаяся в вирионе обратная транскриптаза?

Каковы особенности размножения ретровирусов, почему они получили такое название?

Какие механизмы лежат в основе противовирусного иммунитета?

Как распознают Т-киллеры клетки, инфицированные вирусом?

Какую роль играют в патологии человека вирусы Коксаки и ЕСНО?

Каковы методы диагностики заболеваний, вызываемых энтеровирусами?

Почему для диагностики вирусного гепатита А наиболее приемлемой является методика "захвата" антител, относящихся к иммуноглобулинам класса IgM?

Какие Т-лимфоциты обеспечивают защиту организма от вирусов?

С помощью какой серологической реакции можно определить наличие вируса иммунодефицита в организме человека и в чем сущность этой реакции?

Что такое иммуноблотинг и для какой цели он применяется?

Почему лица, пораженные вирусом иммунодефицита, становятся легко восприимчивыми к различным, даже слабо патогенным, микроорганизмам, иначе говоря,почему у них часто развиваются оппортунистические инфекции?

Какие типы симметрии известны у вирусов?

Как проникает в организм вирус гриппа и из каких основных этапов складывается процесс его внутриклеточного размножения?

Каково значение гемагглютининов вируса гриппа?

Каков механизм противовирусного действия интерферона? Как происходит заражение гепатитом В?

Какие клетки поражает вирус иммунодефицита человека и как он распознает их, т.е. какие рецепторы содержат эти клетки для вируса?

Что такое лизогения и лизогенная конверсия и какими фагами она вызывается - вирулентными или умеренными?

Каковы механизмы персистирования вирусов в организме человека?

Каким образом бактериофаг может изменить генетические свойства бактерий?

Что такое первично-трипсинизированные культуры клеток и перевиваемые культуры клеток?

Каким образом РНК-содержащие вирусы могут интегрировать в хромосому клетки?

Каким образом онкогенные вирусы вызывают трансформацию нормальных клеток в злокачественные? Что такое протоонкоген и онкоген?

Почему вирусы являются облигатными паразитами?

Как устроен вирус дельта-гепатита? Какой нуклеиновой кислотой представлен его геном?

Каков механизм реакции торможения гемагглютинации?

Из каких основных этапов складывается процесс взаимодействия вируса СПИДа с клеткой?

Какие типы антигенной изменчивости вируса, гриппа Вы знаете и каково их значение в эпидемиологии этой болезни?

Каков механизм формирования вириона гриппа в клетке?

Как осуществляется специфическая профилактика бешенства и какие препараты применяются для этой цели и в каких случаях?

Как осуществляется микробиологическая диагностика бешенства?

Как устроены аденовирусы, чем представлен их геном, какой тип симметрии имеет вирион и сколько у него капсомеров?

Каковы особенности репликации вирусов, у которых геном представлен однонитчатой ДНК?

о Каковы особенности репликации вирусов, у которых геном представлен однонитчатой РНК?

Какая разница между позитивными и негативными вариантами однонитчатых РНК-геномов?

В чем заключается сущность радиоимиунного метода (РИМ) диагностики инфекционных заболеваний?

Рис.2 Структура вириона HBV

Рис.3 Геном HBV

ЧАСТЬ III

ЧАСТНАЯ МЕДИЦИНСКАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ

ЗАНЯТИЕ 1

Дата______________

Тема: МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЙ ДИАГНОЗ КОККОВЫХ

ИНФЕКЦИИ.

План занятия

1. Изучение морфологии и культуральных свойств стафилококков.

2. Изучение морфологии и культуральных свойств стрептококков.

3. Бактериологическое исследование гноя: микроскопия и посев та кровяной агар.

4. Исследование флоры зева. Микроскопия и посев на кровяной агар.

5. Бактериологическое исследование крови. Посев крови на са­харный МПБ (демонстрация).

Методические указания

§ I. Обратить внимание на внешний вид культур стафилококков мутность, осадок в МПБ; характер налета, степень прозрачности и наличие пигмента на МПА. Приготовить и окрасить по Граму препараты всех видов стафилококков, выросших на плотных и жидких питательных средах. Препараты зарисовать.

§ 2. Обратить внимание на внешний вид культур стрептококков на жидких и плотных средах - придонно-пристеночный рост на сахарном бульоне, величину колоний и наличие зоны гемолиза или позеленения на кровяном МПА. Приготовить и окрасить по Граму препараты-мазки из культур гемолитического и зеленящего стрептококков с кровяного МПА и сахарного МПБ. Сравнить морфологию одного и того же вида стрептококка, выращенного на жидких и плотных питательных средах. Препараты зарисовать.

§ 3. Приготовить из гноя препарат-мазок и окрасить его по Граму. Обратить внимание на взаиморасположение кокков в препаратах-мазках из гноя. Препарат зарисовать. Произвести посев гноя петлей штриховым способом на половину чашки с кровяным или молочно-желточно-солевым МПА.

§ 4. Взять материал со слизистой зева друг у друга стерильным ватным тампоном. Для приготовления мазка материал с тампона растереть на поверхности предметного стекла, предварительно прокаленного и остуженного (стекло должно быть стерильным, чтобы не загрязнить тампон). После приготовления мазка тем же тампоном произвести посев на половину чашки с кровяным МПА. Приготовленный мазок зафиксировать, окрасить по Граму и промикроскопировать. Обратить внимание на наличие в мазке кокков и характер их взаиморасположения.

Рис.1 Золотистый стафилококк на МПА

Рис.2 Золотистый стафилококк на МПБ

Контрольные вопросы

Чем отличается морфология стафилококков на плотных и жидких питательных средах?

Каков характер роста стафилококков на жидких и плотных питательных средах?

Рис.3 Эпидермальный стафилококк на МПА

Рис.4 Эпидермальный стафилококк на МПБ

Рис.5 Гемолитический стрептококк на кровяном МПА

Рис.6 Гемолитический стрептококк на сахарном МПБ

Рис.7 Зеленящий стрептококк на кровяном МПА

Рис.8 Зеленящий стрептококк на сахарном МПБ

Рис.9 Мазок из гноя

Рис.10 Мазок из зева

Какова классификация стафилококков?

Какие заболевания вызывают стафилококки?

Какой материал берут от больных при различных стафилококк; заболеваниях и как его доставляют в лабораторию?

Какие микробиологические методы используют для диагностики заболеваний, вызываемых гноеродными кокками?

Как производят бактериологическое исследование гноя при стафилококковых заболеваниях?

Как производят выделение гемокультуры при стафилококковом сепсисе?

Какова морфология стрептококков? Чем отличается их морфология на жидких и плотных питательных средах?

Какова классификация стрептококков по характеру роста на кровяном МПА?

Каково антигенное строение стрептококков?

Какие серологические классификации стрептококков существуют и на чем они основаны?

Как производят определение групп и типов стрептококков?

Какие заболевания вызывают стрептококки?

Какой материал берут от больных при различных стрептококковых заболеваниях и как его доставляют в лабораторию?

Как производят бактериологическое исследование при различных стрептококковых заболеваниях?

Какие питательные среда применяются для выращивания стрептококков?

Каковы особенности роста стрептококков на жидких и плотных питательных средах?

Какое значение имеет определение титров анти-0-стрептолизина и антигиалуронидазы?

Каковы отличительные признаки энтерококков?

Какое значение имеет М-антиген стрептококков?

Методы микробиологической диагностики стафилококковых и стрептококковых инфекций

А. Бактериологический

Рис.11 СХЕМА

Материал из зева, носа,отделяемое ран,кровь,гнои

Б. Серологический

1. Определение анти-0-стрептолизина.

2. Определение антигиалуронидазы.