Методика постановки реакции обратной пассивной гемагглютинации для определения поверхностного антигена вируса гепатита В

Определение поверхностного антигена вируса гепатита В (HB_SAg) в сыворотке больного или носителя осуществляется с помощью анти-тельного эритроцитарного диагностикума, который представляет собой лиофилизированные формалинизированные куриные эритроциты с адсорбированными: на них антителами к НВ_sАg.

К содержимому ампулы с сенсибилизированными эритроцитами до­бавляют 5 мл 0,9%-ного раствора натрия хлорида (ФР). Исследуемую сыворотку разводят 1:8. Для этого в лунку планшета вносят при по­мощи пипеточного дозатора 200 мкл ФР, добавляют 25 мкл исследуемой сыворотки крови, перемешивают и 25 мкл приготовленного разведения переносят в пустую луночку планшета. В качестве контрольных образ­цов используют сыворотку заведомо положительную в разведении 1:8 и ФР. В лунки, содержащие по 25 мкл исследуемых проб, добавляют 25-33 мкл 1%-ной взвеси сенсибилизированных эритроцитов. Реагенты переме­шивают постукиванием о край планшета в течение 30 ,сек и выдерживают 20-30 мин при комнатной температуре. Результаты РОПГА считают отри­цательными при отсутствии гемагглютинации с исследуемой сывороткой и ФР, но при наличии ее в заведомо положительной пробе. Все сыворот­ки, агглютинирующие сенсибилизированные эритроциты, исследуют в под­тверждающем тесте. Суть его состоит в том, что в лунках планшета готовят два ряда двукратных разведений исследуемой сыворотки крови от 1:2 до 1:256 в объемах по 25 мкл. В контрольный ряд добавляют несенсибилизированные эритроциты. Планшеты с разведениями выдер­живают не менее 30 минут при комнатной температуре, а затем добавляют в оба ряда по 25-33 мкл сенсибилизированных эритроцитов. Ре­зультаты реакции считают положительными, если в опытном ряду наблюдается по крайней мере 4-х кратное снижение титра исследуемой сыворотки.

А. ВИРУСНЫЕ ГЕПАТИТЫ

Известны следующие формы вирусных гепатитов:

1.Гепатит А (инфекционный гепатит).

2.Гепатит В (сывороточный гепатит).

3.Гепатит-дельта - эпидемиологически сходен с гепатитом В, но вызывается дельта-вирусом.

4.Гепатит С (гепатит ни А ни В) - заражение происходит главным образом парентеральным путем, но возбудитель отличается от вирусов А и В.

5.Гепатит Е (гепатит ни А ни В) - заражение происходит, как при гепатите А, главным образом фекально-оралъным путем, но возбу­дитель отличается от вирусов А и В.

Вирус гепатита А - изометрический РНК-содержащий вирус. Геном представлен однонитчатой позитивной РНК с м.м. 2,6 млн. Диаметр вириона 27 нм, суперкапсида нет, тип симметрии кубический, икосаэдр. Капсид имеет 32 капсомера Оболочка образована 4 полипептидами.

Возбудитель гепатита В - ДНК-содержащий сферический вирус. Диаметр вириона 42 ны. Геном представлен двунитчатой кольцевидной ДНК с м.м. 1,6 млн; одна нить имеет брешь. Вирион содержит обратную транскриптазу, принимающую участие в репликации. С ее участием происходит синтез на прегеномной РНК вначале минус, а затем плюс-цепей ДНК, в составе генома только четыре гена: S,С,Р и X. Оболочка вириона состоит из трех белков (главного, большого и среднего). Схему строения вириона см. на стр.124.

В составе вириона имеется три основных антигена: НВSАg-поверхностный антиген; 2)НВсАg - сердцевинный и 3) антиген НВeАg.

Возбудитель дельта-гепатита имеет сферическую форму с диаметром З5-37 нм.

Геном представлен РНК с м.м. 500000. Внешняя оболочка вириона состоит из поверхностного антигена вируса гепатита В (НВ_SАg), а при ее разрушении выделяется компонент со специфической антигенностью (дельта-антиген).

Б. Культивирование вирусов гепатитов удается с большим трудом и требует соблюдения ряда условий. В нашей стране разработан метод культивирования вируса гепатита А в культуре клеток 4647 (перевиваемая линия клеток почек зеленых мартышек).

В. Для профилактики гепатита А создаются различные вакцины:

1.Цельновирионные из ослабленных или инактивированных (формоловые) вирусов вакцины.

2.Субвирионные вакцины.

3.Вакцины химические (из химических аналогов антигенных детерминант вируса).

4.Генно-инженерные вакцины (гены вируса гепатита А рекомбинированы в геном вируса осповакцины).

Одним из важных условий борьбы с гепатитом В в глобальном пла­не, по мнению ВОЗ, является массовая иммунизация новорожденных и детей раннего возраста. Полный курс иммунизации против гепатита В состоит из трех прививок: первая доза вводится сразу после рождения, вторая через 1-2 месяца и третья - до конца первого года жизни ребенка.

Для вакцинации против гепатита В применяется два типа высоко эффективных вакцин: плазменная вакцина (плазма хронических носителей вируса содержит огромное количество поверхностного антигена ви­руса гепатита В, он извлекается и надежно обезвреживается) и реком-бинантная генно-инженерная вакцина, которая готовится на основе рекомбинантного клона дрожжей, несущего гены НВsАg.

ЗАНЯТИЕ 5

Дата___________________

Тема: МИКРОБИОЛОГИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА СИНДРОМА ПРИОБРЕТЕННОГО ИММУНОДЕФИЦИТА ЧЕЛОВЕКА (СПИДа)

План занятия

1.Особенности структурной организации вируса и его генома.

2.Механизм взаимодействия вируса СПИДа с клеткой, особенности
патогенеза инфекции.

3.Вирусологическая диагностика ВИЧ-инфекции.

4.Серологическая диагностика ВИЧ-инфекции:

а)определение противовирусных антител у больных и носителей с помощью коммерческих тест- систем; демонстрация;

б)метод иммуноблотинга и его значение.

5.Знакомство с иммунопрепаратами, применяемыми для диагностики, профилактики и лечения вирусных заболеваний. Обязательные прививки против кори, полиомиелита и гепатита В.

Методические указания

§ I. Вирус СПИДа (ВИЧ) имеет шаровидную форму, его диаметр 100 нм. Оболочка вируса имеет форму многогранника, составленного из 12 пятиугольников и 20 шестиугольников. В центре и углах каждого шестиугольника расположены молекулы gp120 (всего 80 молекул на вирион), оболочка содержит двойной слой липидов, над которыми выступают молекулы gp120, а через мембрану проходит трансмембранный белок gр41.

Сердцевина вириона имеет форму снаряда, составляющие его моле­кулы из трех-четырех белков образуют поверхность в виде дельта-ико­саэдра.

Белок gp120 является рецептором вируса, взаимодействующим с рецептором СД4 чувствительных к нему клеток (Т- лимфоциты, макрофаги, моноциты).

В сердцевине вириона содержится его геном. Он представлен двумя идентичными молекулами РНК (у ВИЧ-1 из 9213 нуклеотидов), двумя молекулами затравочной РНК, двумя молекулами полимеразы, обладающей пятью активностями (протеазной, обратной транскриптазы, РНК-азы, ДНК-зависимой ДНК-полимеразы и эндонуклеазы, или интегразы). РНК связана с нуклеокапсидным белком.

Особенности организации генома

ДНК провируса (ВИЧ-1) состоит из 9283 нуклеотидных пар (н.п.) и фланкирована LTR из 638 н.п.

В составе генома (ДНК-провируса) девять генов, которые контро­лируют синтез 8 структурных и 6 регуляторных белков:

gag - p17, р30, р15 - эти белки образуют сердцевину вириона;

роl - р12 (протеаза). р51 - p66 (обратная транскриптаза , РНКаза Н, ДНК-зависимая ДНК-полимераза), р32 (интеграза, или эндонуклеаза);

env- белки оболочки (gp120, gp41).

Указанные восемь белков входят в состав вириона.