Тема 8.3. МИКРОФЛОРА ОРГАНИЗМА ЧЕЛОВЕКА

План

Программа

Особенности и основные понятия экологии микроор­ганизмов.

Качественные и количественные методы изучения со­става микрофлоры отдельных биотопов.

Значение нормальной микрофлоры в жизни человека.

Микробиологическое исследование при дисбактериозе.

а Демонстрация

Окрашенные мазки, приготовление из чистых культур бактерий, представителей облигатной микрофлоры че­ловека. Рост на скошенном агаре E.coli, Proteus vulgaris,
Staphylococcus epidermidis.

Микрофлора зубного налета.

Задание студентам

1. Приготовить мазки из зубного налета, микроскопиро-вать и зарисовать; сделать заключение.

кровяной агар, для выделения E.coli— на среду Эндо, для вы­деления дрожжеподобных грибов рода Candida — на среду Са-буро. Посевы производят таким образом, чтобы получить со­считываемое количество колоний. Такие исследования повто­ряют через определенные сроки, чтобы сделать заключение о количественных изменениях состава микрофлоры в динамике заболевания (табл. 8.3.1).

Таблица 8.3.1. Состав нормальной, резидентной микрофлоры биото­пов организма человека

Микрофлора биотопа

Ориентировочное содержание микробов

Кровь, лимфа, внутренние органы, головной и спинной мозг, спинномозговая жидкость

г—сравнительно часто встречаются: i Vaphylococcus epidermidis \saprophyticus (+) А пеЬас1епит spp. (+) А rtococcus spp. (+) А Г/Ля fo. (+) А зрр. А mas aeruginosa (-) А

1ечный тракт ^благоприятные условия для

йикрофлоры:

ъиз salivarius,

mitis, S. mutatis, S.sanguis (+) A Lactobacillus spp. (+) ah Bifidobacterium spp. (+) ah Leptotrichia buccalis (—) Veilonella spp. (—) ah Bacteroides spp. (-) ah Candida spp. A Treponema skoliodontum, T.denticola (—) A Neissena spp. (-) A Mycoplasma spp. A Staphylococcus spp. (+) A

Желудок — многие микроорганизмы погиба­ют при кислом значении рН, встречаются:

Sarcina ventriculi (+) А

Lactobacillus spp. (+) А

Candida spp. A

Тонкая кишка — в верхних отделах кишки микрофлора представлена скудно в связи с активностью ферментов. Число микроорга­низмов постепенно нарастает в илеоцекальном отделе

В норме не содержат микробов и являются стерильными

10²-10⁴ на 1 см³

10⁸ в 1 мл слюны

Не более 10³ в 1 мл содержимого

Около 10⁵ в 1 мл со­держимого

Продолжение

Микрофлора биотопа

Ориентировочное содержание микробов

Толстая кишка — благоприятные условия для 10¹⁰ в 1 г фекалий

разнообразной микрофлоры, выделяются с

фекалиями:

Анаэробы (в совокупности)

Bacteroides spp. (—)

Bifidobacterium spp. (+)

Lactobacillus spp. (+)

Clostridium spp. (+)

Veilonella spp. (—)
Аэробы

E.coli и др. энтеробактерии (—)

Streptococcus faecalis (+)

Bacillus spp. (+)

Конъюнктива глаза — очень часто микроор­ганизмы полностью отсутствуют, могут встре­чаться:

Staphylococcus epidermidis (+) А

Corynebacterium spp. (+) А

Уши (наружный слуховой проход) — факуль­тативно встречаются:

Staphylococcus epidermidis (+) А

Corynebacterium spp. (+) А

Candida spp. A

Дыхательная система (верхние дыхательные пути)

Staphylococcus saprophyticus (+) А

Streptococcus spp. (+) А

Klebsiella spp. (—) A

Neisseria catarralis (-) A
Candida spp. и др.

Мелкие бронхи, альвеолы и паренхима легких обычно не содержат микробов Мочеполовая система

Число микробов в со­вокупности составля­ет 10¹⁰ в 1 мл влага­лищного секрета. Со­отношение анаэробов к аэробам 10:1

Стерильна

Женские половые органы (влагалище и шей­ка матки)

Lactobacillus spp. (+) ан

Corynebacterium spp.

(+)Ан

Peptococcus spp.

Полость матки —

Мужские половые органы

Mycobacterium smegmatis (+) А

Corynebacterium spp. (+) А

Staphylococcus epidermidis (+) A

и др.

Микрофлора биотопа Ориентировочное содержание микробов Дистальная треть уретры (женщин и муж­чин) Peptostreptococcus spp. (+) ан Peptococcus spp. (+) ан Corynebacterium spp, (+) A Mycoplasma hominis A Staphylococcus epidermidis (+) A Моча в почках, мочеточниках и мочевом пу- Стерильна зыре При естественном мочеиспускании микробы Число микробов не попадают в мочу с наружного участка уретры должно превышать 103 КОЕ/мл

Бактериологическое исследование трупов павших жи­вотных.

Методы изучения факторов вирулентности бактерий:

а) изучение взаимодействия лиганд-рецепторного ап­парата;

б) определение токсигенности микробов;

в) определение ферментов патогенности.

5. Особенности вирусных инфекций.

а Демонстрация

Капсула патогенных бактерий; окраска по методу Бурри—Гинса.

Корд-фактор Mycobacterium tuberculosis (метод Прайса); окраска по методу Циля—Нильсена.

а Задание студентам

Зарисовать демонстрируемые препараты: а) капсулу патогенных бактерий; б) корд-фактор М.tuberculosis.

Микроскопировать и зарисовать окрашенные метиленовым синим мазки-отпечатки из органов белой мы­ши, павшей после заражения культурой патогенных
бактерий. Определить присутствие бактерий во внут­ренних органах и тканях. Сделать заключение о форме инфекции и возможных причинах гибели животного.

Микроскопировать мазок со слизистой оболочки, ок­рашенный по методу Романовского—Гимзы. Найти и зарисовать "ключевые" клетки, покрытые адгезированными бактериями.

Микроскопировать и зарисовать мазок, демонстрирующий явление незавершенного фагоцитоза гонококков; окраска по методу Грама.

Учесть результаты опытов, поставленных с целью вы­явления факторов вирулентности стафилококков: ге­молизина, лецитиназы, плазмокоагулазы.

Определить гемолитическую активность бактериаль­ного экзотоксина (О-стрептолизина).

а Методические указания

Бактериоскопические методы выявления факторов вирулент­ности. Обнаружение капсулы у стрептококков (см. тему 2.2).

Выявление корд-фактора микобактерий. При выра­щивании микобактерий на предметных стеклах, погруженных в жидкую среду на основе цитратной крови, вирулентные штаммы вырастают в виде переплетающихся тяжей — корд-фактор. Для их обнаружения стекла окрашивают по методу Циля—Нильсена (см. рис. 14.3.2).

Выявление адгезии бактерий. При некоторых инфек­циях бактерии в большом количестве прикрепляются к мембране эпителиальных клеток. Обнаружить это явление можно с помощью микроскопических методов в мазках со слизистой оболочки пораженного органа, окрашенных по методу Рома­новского— Гимзы. Такие клетки получили название ключевых.

Выявление незавершенного фагоцитоза (см. рис. 15.2.1). При микроскопии наблюдается большое количество неразрушенных микроорганизмов, расположенных внутри про­фессиональных фагоцитов.

Определение экзоферментов и экзотоксинов — факторов па-тогенности. Гиалуронидаза гидролизует гиалуроновую кис­лоту, которая перестает образовывать сгусток при добавлении уксусной кислоты. Для определения этого фермента в пробир­ку с субстратом (гиалуроновой кислотой) вносят суточную культуру бактерий или фильтрат бульонной культуры и инку­бируют в течение 15 мин при 37 °С. Затем добавляют 2—3 капли концентрированной уксусной кислоты. В пробах, где содержится гиалуронидаза, не происходит образования сгустка.

Плазмокоагулаза выявляется при посеве испытуемой культуры в 0,4 мл стерильной цитратной плазмы крови. Посе­вы ингибируют при 37 °С в течение 2—5 ч. В случае выработки фермента происходит свертывание плазмы, а в контроле она остается жидкой.

Гемолизин определяют путем посева испытуемой куль­туры "бляшками" в чашки Петри с кровяным агаром. Чашки инкубируют в термостате при 37 °С в течение суток. В поло­жительном случае вокруг "бляшек" образуются прозрачные зоны гемолиза.

Определение титра гемолитической активности бактериального экзотоксина (0-стрептолизина). Из фильтрата бульонной культуры р-гемолитического стрептокок­ка готовят ряд двукратных серийных разведений. К каждому из них добавляют равный объем 5 % взвеси отмытых эритро­цитов кролика. Смесь инкубируют в термостате при темпера­туре 37 °С в течение 1 ч. Параллельно инкубируют контроль­ную взвесь эритроцитов в питательном бульоне того же соста­ва. Учет результатов производят по наличию гемолиза (крас­ная, прозрачная "лаковая" кровь) или отсутствию гемолиза (осадок эритроцитов). Определяют наибольшее разведение (титр) фильтрата бульонной культуры стрептококка, при кото­ром еще наблюдается гемолиз. В дальнейшем этим разведением пользуются при определении рабочей дозы О-стрептолизина для постановки антистрептолизиновой реакции.

Лецитиназа выявляется при посеве на агар с лецитином. Вокруг колоний бактерий, выделяющих фермент, образуется зона помутнения с перламутровым блеском.

Лецитиназная проба: для быстрого обнаружения и се­рологической идентификации а-токсина клостридий — возбу­дителей газовой гангрены — в раневом отделяемом определяют его лецитиназную активность в реакции нейтрализации с анти­сыворотками против токсинов клостридий разных видов (см. табл. 12.2.2). С этой целью исследуемый материал (раневое отделяемое) помещают в пробирки с раствором лецитина и добавляют антисыворотки. Присутствие лецитиназы в раневом отделяемом проявляется помутнением жидкости в пробирке. При нейтрализации лецитиназной активности токсина соот­ветствующей антисывороткой жидкость остается прозрачной. Цитотоксины. Для обнаружения некоторых бактериаль­ных токсинов, оказывающих цитопатическое действие на клет­ки (ЦПД), используют клеточные культуры. Бактерии выращи­вают в бульоне. Затем питательную среду отделяют от микро­бов и вносят в культуру чувствительных клеток. В положитель­ном случае после инкубации наблюдается характерное ЦПД. Бактериальные токсины различаются по характеру ЦПД, ко­торое может проявляться изменением формы, размеров клетки, появлением вакуолей в цитоплазме, нарушением целостности клеточного монослоя и т.д.

Методы определения вирулентности бактерий и активности бактериальных токсинов на экспериментальных животных

Экспериментальное заражение животных. Инфек­ционный процесс может быть искусственно воспроизведен пу­тем заражения лабораторных животных: кроликов, морских свинок, белых мышей, белых крыс и др. Это производится для изучения патогенности и вирулентности микроорганизмов, вы­деления чистой культуры возбудителя из различных материалов (метод биопробы), воспроизведения экспериментальной ин­фекции и других целей.

Заражают животных накожно, внутрикожно, подкожно, внутримышечно, внутривенно, внутрибрюшинно, перорально, интраназально, интратрахеально и интрацеребрально. Все ма­нипуляции осуществляют с помощью стерильных инструмен­тов. Перед началом опыта животных отбирают, взвешивают и маркируют. Мышь берут за хвост, опускают на стол, туловище быстро прижимают к столу двумя пальцами и, скользя ими по спине, захватывают кожу над головой и фиксируют животное в левой руке в растянутом положении. Взвесь микроорганиз­мов определенной концентрации набирают в шприц через иг­лу. Шприц держат как писчее перо в правой руке. При под­кожном заражении иглой прокалывают кожную складку на спине или у корня хвоста и медленно вводят содержимое шприца под кожу. Затем иглу быстро извлекают, прикрыв место инъекции ватой, смоченной спиртом. При внутрибрю-шинном заражении животное фиксируют головой вниз, чтобы кишечник переместился к диафрагме. В левой нижней трети живота делают прокол кожи, удерживая иглу под острым уг-

пипетки выдувают в пробирку со средой. Из ткани легких готовят мазки-отпечатки и делают посевы.

Брюшную полость вскрывают продольным разрезом брю­шины ножницами, не задевая кишечник. Осматривают органы брюшной полости, отмечая в протоколе наличие экссудата, величину, цвет и консистенцию печени, селезенки, надпочеч­ников, брыжеечных лимфатических узлов. При необходимости делают посевы из этих органов на питательные среды.

Для приготовления мазков-отпечатков вырезают из печени, селезенки, почек небольшие кусочки ткани, берут их пинцетом и прикасаются к предметному стеклу поверхностью разреза. Мазки-отпечатки фиксируют в жидком фиксаторе и окраши­вают метиленовым синим. При микроскопии отмечают при­сутствие микроба-возбудителя в различных органах и тканях. Результаты посевов учитывают на следующий день после ин­кубации в термостате. Данные вскрытия трупа протоколируют. Труп животного после вскрытия подлежит уничтожению.

Глава 10

ПРИКЛАДНАЯ ИММУНОЛОГИЯ

Достижения современной фундаментальной иммунологии находят применение в области прикладной иммунологии, ко­торая занимается вопросами иммунодиагностики, иммунотера­пии, иммунопрофилактики и иммунокоррекции. Иммунодиаг­ностика решает несколько разных диагностических задач: оценки иммунного статуса организма, выявления и идентифи­кации специфических антигенов, выявления и количественно­го определения содержания специфических антител в сыворот­ке крови и других биологических жидкостях (серодиагностика), оценки эффективности клеточного и гуморального специфи­ческого иммунного ответа на конкретный антиген. Иммуноте­рапия включает применение иммунных сывороток или имму­ноглобулинов, содержащих специфические антитела, с целью лечения или экстренной профилактики конкретного заболева­ния путем создания пассивного иммунитета, а именно — вве­дения в организм готовых антител, способных нейтрализовать токсин или вирус и обеспечить специфическую защиту против возбудителя. Значительно реже с целью лечения хронических инфекций применяют препараты вакцин. Вакцины и анаток­сины составляют арсенал иммунопрофилактики, которая пре­следует цель индуцировать в организме человека выработку собственного активного иммунитета против конкретного анти­гена, входящего в состав вакцины или анатоксина. При выяв­лении у больного какого-либо типа иммунопатологии с целью иммунокоррекции используют препараты: иммунодепрессанты или иммуностимуляторы.

План

Программа

Методы выявления и идентификации специфических антигенов, основанные на реакциях непосредственно­го связывания антигена с антителами: иммунофлюоресцентный метод, радиоиммунный метод, иммуноферментный метод.

Методы выявления и идентификации специфических антигенов, основанные на реакциях связывания анти­гена с антителами, проявляющихся изменением свойств антигена: реакция агглютинации, реакция преципита­ции, реакция иммобилизации, реакция нейтрализа­ции.

Демонстрация

Иммунофлюоресцентный метод для индикации при­сутствия в исследуемом материале возбудителей: бак­терий или вирусов.

Наборы ингредиентов для иммуноферментного и ра­диоиммунного методов.

Иммуноэлектрофореграммы.

Задание студентам

Поставить ориентировочную реакцию агглютинации на стекле с целью идентификации выделенной чистой культуры бактерий. Сделать заключение по результа­там реакции.

Протоколировать и оценить результаты РИГА, постав­ленной с целью выявления и идентификации бакте­риального экзотоксина в исследуемом материале. Сде­лать заключение по результатам реакции.

Протоколировать и оценить результаты реакции пре­ципитации в геле, поставленной с целью определения токсигенности возбудителя дифтерии. Сделать заклю­чение по результатам реакции.

Протоколировать и оценить результаты РТГА, постав­ленной с целью идентификации по гемагглютининам выделенного вируса гриппа. Сделать заключение по результатам реакции.

Методические указания

1. Иммунофлюоресцентный анализ. Один из наиболее чувст­вительных методов выявления связывания антител с антигена­ми в клетках и тканях — Иммунофлюоресцентный анализ. Спе­циальный флюоресцентный краситель (флюорохром) прикреп­ляется химической связью к молекуле специфического анти­тела, не нарушая его специфичности. Часто используют кра­ситель изотиоцианат флюоресцеина, обладающий желто-зеле­ной флюоресценцией. Красители, выбранные для иммунофлюоресцентного метода, активируются светом одной длины вол­ны (чаще — ультрафиолетовой части спектра), а сами испуска­ют лучи другой длины волны (видимого спектра). В люмине­сцентном микроскопе используется в качестве источника све­та, возбуждающего люминесценцию, ртутная лампа с системой селективных фильтров, пропускающих в окуляр только свет флюоресцирующего красителя. Прикрепляя разные красители к разным антителам, можно одновременно выявлять несколько антигенов в одной клетке.

Иммунофлюоресцентный метод является методом выбора для быстрого выявления и идентификации неизвестного мик­роорганизма в исследуемом материале, в связи с чем его на­зывают методом экспресс-диагностики.

Недостатком прямого иммунофлюоресцентного метода яв­ляется необходимость приготовления широкого набора флюо­ресцирующих специфических антител против каждого из изу­чаемых антигенов. Поэтому чаще используют непрямой имму-нофлюоресцентный метод, при котором связанные с антиге­ном специфические антитела (немеченые) выявляются с помо­щью флюоресцирующих антииммуноглобулиновых антител против иммуноглобулинов того вида, которому принадлежат антиген-специфические антитела.

Применяют и иммуногистохимический метод, при котором к специфическим антителам прикрепляется фермент (напри­мер, пероксидаза хрена), способный превратить бесцветный субстрат в окрашенные продукты его ферментативного разло­жения, видимые в обычный световой микроскоп.

Для использования при электронной микроскопии антиген-специфические антитела можно метить частицами золота, ло­кализация которых укажет на расположение соответствующего антигена.

При прямом иммунофлюоресцентном методе Кунса спе­цифические флюоресцирующие антитела образуют комплексы с микробными антигенами, которые светятся при люмине­сцентной микроскопии препаратов (рис. 10.1.2).

Непрямой метод предусматривает использование одной универсальной флюоресцирующей сыворотки — антиглобули-новой, содержащей антитела против кроличьих глобулинов, поскольку диагностические антисыворотки получают путем иммунизации кроликов. При этом на образующемся комплексе (специфические антитела + исследуемый антиген) фиксируют­ся флюоресцирующие антиглобулиновые антитела, обеспечи­вая его свечение при люминесцентной микроскопии (см. рис. 10.1.2).

На предметном стекле готовят мазок из исследуемого мате­риала, фиксируют на пламени и обрабатывают иммунной кро­личьей сывороткой, содержащей антитела против антигенов возбудителя. Для образования комплекса антиген—антитело

Повышение специфичности и чувствительности иммуно-ферментного анализа, так же как и иммунофлюоресцентного и радиоиммунного методов, связано с использованием моно-клональных антител (МКАТ).

Для получения МКАТ мышей иммунизируют очищенным препаратом антигена, затем выделяют лимфоциты из селезенки и лимфатических узлов и проводят слияние их с миеломными клетками-партнерами. Неслившиеся миеломные клетки поги­бают, так как они дефектны по синтезу некоторых нуклеотидов и не могут выжить на селективной среде без этих нуклеотидов. Неслившиеся лимфоциты погибают в культуре из-за отсутст­вия в среде необходимых им трофических факторов. Выживают только гибридные клетки (гибридомы), унаследовавшие от ми-еломных клеток способность к пролиферации в культуре, а от лимфоцитов — способность к синтезу антител соответствую­щей специфичности. Надосадочную жидкость культур гибри­дом исследуют с помощью ИФА с соответствующим антиге­ном. После выявления клеток, секретирующих нужные анти­тела, их клонируют методом лимитирующих разведений, т.е. клетки разводят таким образом, чтобы получить дочернюю культуру из одной клетки. Тогда все потомство будет генети­чески идентично: одна клетка дает один клон, который проду­цирует МКАТ.

3. Радиоиммунный анализ. Радиоиммунный анализ (РИА) является чрезвычайно чувствительным методом, который мо­жет быть использован для количественного определения лю­бого антигена. Чувствительность метода позволяет выявлять незначительные количества антигена.

Для проведения жидкостного радиоиммунного анализа очи­щенный известный антиген метят радионуклидами, чаще всего ¹²⁵1. В этом случае используют конкурентный вариант связы­вания, когда для определения количества антигена в исследу­емом образце оценивают его способность конкурировать с меченым референс-антигеном в связывании со специфическими антителами. Образующиеся комплексы антиген—антитело выде­ляют осаждением (сульфатом аммония или антиантителами) и определяют их радиоактивность в сопоставлении с радиоактив­ностью несвязанного антигена в надосадочной жидкости. Ис­пользование ряда концентраций немеченого антигена позволяет построить стандартную калибровочную кривую, с помощью которой определяется концентрация исследуемого антигена.

Более современный метод — твердофазный РИА, при кото­ром специфические антитела фиксируются на твердой фазе, к ним добавляется исследуемый антиген, а затем меченый стан­дартный антиген. Определение связанной и несвязанной метки позволяет построить калибровочную кривую и определить ко­личество исследуемого антигена.

РИА широко применяют для количественного определения различных веществ: гормонов (инсулина, гормона роста, адре-нокортикотропного гормона, трииодтиронина, тироксина, эст­рогена), белков сыворотки крови (IgE, сс-фетопротеина и др.), метаболитов (фолиевой кислоты, циклических нуклеотидов и др.), лекарственных препаратов (дигоксина, дигитоксина, мор­фина), микробных антигенов (HBsAg).

4. Реакция агглютинации. В лабораторной диагностике ин­фекционных заболеваний реакцию агглютинации очень часто применяют для идентификации видов и сероваров (серотипирование) бактерий с помощью диагностических агглютиниру­ющих сывороток. Реакция агглютинации (РА) на стекле (плас­тинчатая реакция агглютинации) ставится с одним разведением диагностической агглютинирующей сыворотки, которое в за­висимости от ее титра составляет 1:10, 1:25, 1:50 или 1:100.

Предметное стекло делят на квадраты восковым каранда­шом. В один квадрат наносят каплю изотонического раствора хлорида натрия, в другой — каплю сыворотки. Затем петлей в каждую каплю вносят небольшое количество бактериальной культуры и перемешивают круговыми движениями в каждой капле до получения равномерной взвеси. Стекло можно слегка подогреть, высоко держа над пламенем горелки в течение 2—4 мин. Реакция протекает быстро. Наблюдают за появлени­ем зерен и хлопьев агглютината в каплях. Учет производят через 3—5 мин (рис. 10.1.3).

Кроме специфической агглютинации бактерий, вызван­ной антителами, возможна спонтанная агглютинация (в отсутствие иммунной сыворотки). Спонтанную агглютинацию
дают R-формы бактерий, не образующие гомогенной взвеси в изотоническом растворе хлорида натрия и осаждающиеся в виде клеточных агрегатов. При кислой реакции среды в резуль­тате снятия одноименного заряда с поверхности бактериальных клеток в изоэлектрической зоне также происходит склеива­ние — наступает "кислотная" агглютинация. Чтобы ис­ключить возможность учета ложноположительных результатов спонтанной агглютинации, всегда ставят контрольную пробу с < изотоническим раствором хлорида натрия.

5. Реакция непрямой гемагглютинации. Реакция непрямой гемагглютинации (РИГА) отличается значительно более высокой чувствительностью и специфичностью, чем реакция агг­лютинации. Ее используют для идентификации возбудителя по его антигенной структуре или для индикации и идентификации бактериальных продуктов — токсинов — в исследуемом пато­логическом материале. Соответственно используют стандарт­ные (коммерческие) эритроцитарные антительные диагностикумы, полученные путем адсорбции специфических антител на поверхности танизированных (обработанных танином) эритро­цитов. В лунках пластмассовых пластин готовят последователь­ные разведения исследуемого материала. Затем в каждую лунку

Ингредиенты, мл Опыт- Номер контрольной пробирки ная 1 1 р проба 1234 Стандартная преципитирующая 0,3 — 0,3 0,3 0,3 сыворотка Нормальная кроличья сыворотка — 0,3 — — — Экстракт исследуемого материала 0,3 0,3 — — — Стандартный антиген _____ Контрольный экстракт — — 0,3 — — Изотонический раствор хлорида — — — — 0,3 натрия Результаты

Манипуляции Номера пробирок опытные контрольные 1234 5 1к 2к Зк Приготовление разведе- 1:10 1:20 1:40 1:80 1:160 1:10 — — ний типоспецифической сыворотки Внесение сыворотки, мл 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 — — Внесение суспензии ви- 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 — 0,2 — руса (4 гемагглютини-рующие дозы в 0,2 мл) Внесение изотоническо- — — — — — — 0,2 0,4 го раствора хлорида на­трия, мл Экспозиция 60 мин при комнатной температуре Внесение 1 % суспензии 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 эритроцитов курицы, мл Экспозиция 30—60 мин при комнатной температуре Учет результатов

Типоспецифи- Разведение сыворотки Контроль ческая проти 1 1 1 1 1 вогриппозная 1:10 1:20 1:40 1:80 1:160 сыво- виру- эрит- сыворотка ротки са роци- тов HON1 — + -Н-+ +++ +++ — +++ — H1N1 — ++ +++ +++ +++ — +++ — H3N2 ______ +++ _

Тема 10.2. МЕТОДЫ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ СПЕЦИФИЧЕСКИХ АНТИТЕЛ (СЕРОДИАГНОСТИКА)

Количество специфических антител в сыворотке крови можно определить методами непосредственного выявления связывания со специфическим антигеном. Два наиболее совре­менных метода серологических исследований: радиоиммунный и иммуноферментный. В любом случае нужен известный очи­щенный антиген, к которому прикрепляется метка: радионук-лидная или ферментная. Соответственно связывание меченого антигена с антителами учитывается радиометрическим или спек-трофотометрическим методом.

Кроме методов непосредственного выявления связывания антител с антигеном, используют серологические исследова­ния, основанные на изменении свойств антигена: реакции агглютинации, преципитации, иммунного лизиса, связывания комплемента, нейтрализации.

План

Программа

Методы непосредственного выявления связывания ан­тигена с антителами: радиоиммунный метод, иммуно­ферментный метод, иммунофлюоресцентный метод.

Методы связывания антигена с антителами, проявля­ющегося изменением свойств антигена: реакция агг­лютинации, реакция преципитации, реакции иммун­ного лизиса, реакция связывания комплемента, реак­ции нейтрализации.

Демонстрация

1. Диагностические препараты для выявления антител (диагностикумы).

Задание студентам

Протоколировать и оценить результаты развернутой реакции агглютинации, поставленной с целью опре­деления титра специфических антител в исследуемой сыворотке.

Протоколировать и оценить результаты РИГА, постав­ленной с целью серодиагностики.

Протоколировать и оценить результаты реакции преци­питации в геле, поставленной с целью серодиагностики.

Протоколировать и оценить результаты титрования ком­племента с целью расчета рабочей дозы комплемента.

Протоколировать и оценить результаты реакции свя­зывания комплемента (РСК), поставленной с целью серодиагностики.

Протоколировать и оценить результаты реакции Кумбса, поставленной с целью определения титра непол­ных антител в исследуемой сыворотке.

Протоколировать и оценить результаты иммуноферментного анализа с целью выявления специфических антител в исследуемых сыворотках.

Протоколировать и оценить результаты реакции флоккуляции, поставленной с целью титрования антиток­сической сыворотки.

Протоколировать и оценить результаты антистрептолизиновой реакции, поставленной с целью серодиагностики ревматизма.

10. Протоколировать и оценить результаты РТГА, постав­ленной с целью серодиагностики вирусной инфекции. Сделать заключение по результатам каждой серологи­ческой реакции.

Методические указания

Для приготовления сыворотки взятую из вены кровь в коли­честве 3—4 мл помещают в термостат при 37 °С на 10—15 мин. После свертывания крови сгусток отслаивают от стенок пробир­ки стеклянной палочкой и выдерживают при 4 °С в течение часа для лучшей ретракции сгустка и более полного отделения сы­воротки. Затем сыворотку осторожно отсасывают пипеткой.

1. Радиоиммунный метод. Количество специфических анти­тел в исследуемом образце можно определить, используя вари­ант конкурентного связывания: по их способности ингибиро-вать связывание радиоактивно меченных антител со специфи­ческим антигеном, фиксированным на твердой фазе. Но чаще используют метод выявления связавшихся с антигеном на твер­дой фазе специфических антител с помощью радиоактивно меченных антииммуноглобулиновых антител, специфичных к константной области молекулы иммуноглобулина. Проще все­го получить антииммуноглобулиновую сыворотку путем имму­низации животных одного вида иммуноглобулинами живот­ного другого вида. Такая антииммуноглобулиновая сыворотка будет связывать любые молекулы иммуноглобулинов соответ­ствующего вида (мышей, кроликов или других видов). Такую меченную радионуклидами антииммуноглобулиновую сыво­ротку против иммуноглобулинов человека используют в РИА для выявления связывания немеченых человеческих антител на фиксированном антигене. Эта антииммуноглобулиновая сыво­ротка "распознает" антитела разной специфичности, связыва­ясь с антигенными эпитопами в константной части молекул.

Используя РИА или ИФА, можно определить не только количество антигенспецифических антител, но и принадлеж­ность этих антител к тому или иному изотипу иммуноглобули­нов. Для этого используют антииммуноглобулиновые антитела, специфичные для отдельных изотипов иммуноглобулинов. Получение таких антииммуноглобулиновых антител начинается с иммунизации животного очищенным препаратом одного из изотипов иммуноглобулинов. Из полученной иммунной сыво­ротки путем многократной абсорбции удаляют все антитела, перекрестно реагирующие с иммуноглобулинами других изо­типов. Полученные антиизотипические антитела используют для определения количества антител каждого из изотипов в иммунной сыворотке, реагирующей с антигеном. Особая роль отводится антителам против IgE, которые позволяют опреде­лить количество иммуноглобулинов этого изотипа и специфи­ческих антител, относящихся к этому изотипу, при лаборатор­ной диагностике аллергических реакций анафилактического типа и атонических заболеваний.

Иммуноферментный анализ. Одним из наиболее чувстви­тельных методов выявления антител считается ИФА, который не уступает по чувствительности РИА и в то же время отлича­ется от него большей доступностью для обычных диагности­ческих лабораторий. Специфический антиген адсорбируют на поверхности лунок в пластинах из полистирола (поливинилхлорида). Фиксированный на пластине антиген инкубируют с испытуемыми человеческими сыворотками. После отмывания от несвязавшихся белков связанные иммобилизованными ан­тигенами иммуноглобулины выявляют с помощью антивидовой (античеловеческой) антииммуноглобулиновой сыворотки, меченной ферментом пероксидазой. После инкубации с суб­стратом (пероксидом водорода) и индикатором оценивают фер­ментативную активность по интенсивности окраски. Интен­сивность окраски, пропорциональную количеству сорбирован­ных на антигене антител, можно оценить визуально или с помощью спектрофотометра. В данной модификации удобна универсальность меченого реагента, который позволяет выяв­лять антитела к разным антигенам.

Иммуноэлектрофорез. Для выявления антител, специфи­ческих по отношению к отдельным антигенным компонентам в составе сложной смеси, например к отдельным антигенам
микроорганизмов, приходится прибегать к методам выделения белков из смеси. Одним из наиболее популярных методов выделения белков является электрофорез в полиакриламидном
геле (PAGE) в присутствии додецилсульфата натрия (SDS), который получил сокращенное обозначение: SDS-PAGE. Бел­ковые фракции распределяются в геле в соответствии с их
размерами. После этого разделенные в электрофоретическом поле белки переносят на нитроцеллюлярную пластину, где они обрабатываются специфической антисывороткой. Положение
белков, с которыми связываются специфические антитела, вы­является с помощью антииммуноглобулиновых антител, ме­ченных ферментом или радионуклидом. Этот метод получил
название Western blot и используется в качестве уточняющего при выявлении в сыворотке крови антител против вируса им­мунодефицита человека. Для этого белки вируса разделяют с помощью SDS-PAGE, разделенные белки переносят на плас­тину нитроцеллюлозы и проводят инкубацию с испытуемой сывороткой. Антитела из сыворотки связываются с разными антигенными фракциями, что выявляется с помощью фер-ментно-меченой антииммуноглобулиновой сыворотки против иммуноглобулинов человека.

4. Иммунофлюоресцентный метод. Используется, например, в серодиагностике сифилиса. Мазок из взвеси T.pallidum на стекле обрабатывают исследуемой сывороткой, в которой по­дозревается присутствие специфических антител. Если в сыво­ротке имеются антитела против антигенов спирохеты, они свя­зываются с микробом. Избыток антител удаляют отмыванием.
Мазок дополнительно обрабатывают флюоресцирующей сыво­роткой против человеческих иммуноглобулинов. О выявлении специфических антител в исследуемой сыворотке будет свиде­тельствовать обнаружение светящихся спирохет при люмине­сцентной микроскопии мазка.

Аналогичным методом выявляют антинуклеарные антитела (антитела против ДНК) в сыворотке крови при ряде аутоим­мунных заболеваний, используя в качестве антигена ядерные клетки животного происхождения.

5. Реакция развернутой агглютинации. Сначала готовят основное разведение сыворотки, из которого делают серию раз­ведений путем последовательного переноса 1 мл из предыду­щей пробирки в следующую пробирку ряда. Из последней пробирки 1 мл разведенной сыворотки удаляют для сохранения одинакового объема. В контрольную пробирку (контроль анти­
гена) вносят 1 мл изотонического раствора хлорида натрия. В каждую пробирку с разведениями сыворотки и в контроль­ную пробирку вносят пастеровской пипеткой по 2 капли взвеси
бактерий, содержащей 3 млрд микробных тел в 1 мл. Пробирки встряхивают и помещают в термостат при 37 °С на 2 ч, затем сутки выдерживают при комнатной температуре. Учет реакции развернутой агглютинации производят, оценивая последователь­нл каждую пробирку, начиная с контрольных, при осторожном сшвании. В контрольных пробирках агглютинации не должыть. Интенсивность реакции агглютинации отмечают следу-ми знаками: "++++" — полная агглютинация (хлопья агг-F "1л|бтината в абсолютной прозрачной жидкости), "+++" — непол­на Ля агглютинация Схлопья в слабоопалеспигпто]

* агглютинация (хлопья в слабоопалесцирующей жидкости),

jt ⁽*f+" — частичная агглютинация (хлопья четко различимы, жид­кость слегка мутная), "+" — слабая , сомнительная агглютинация (жидкость очень мутная, хлопья в ней плохо различимы), "—" — отсутствие агглютинации (жидкость равномерно мутная) (рис. 10.2.1).

За титр сыворотки принимают последнее ее разведение, в

Как правило, в центральную лунку заливают стандартный раствор антигена, а в периферические — испытуемые сыворот­ки. В одну из периферических лунок вносят стандартную им­мунную сыворотку соответствующей специфичности, а в дру­гую — нормальную сыворотку для контроля. Антиген с сыво­ротками инкубируют во влажной камере при 37 "С в течение 24 ч, после чего учитывают количество и ширину полос пре­ципитации между центральной лу