Клинико-диагностическое значение определения активности альфа-амилазы

В крови и моче

Активность альфа-амилазы крови и мочи в течение суток (а также от од­ного дня к другому) значительно меняется. Кроме того, отмечены сущест­венные индивидуальные различия этих показателей у обследуемых без пато­логии органов пищеварения. Учитывая колебания экскреции альфа-амилазы с мочой, рекомендуется исследовать активность фермента в моче, со­бранной за сутки.

Изменение активности альфа-амилазы в крови и моче происходит при бе­ременности. Гиперамилаземия. Активность альфа-амилазы значительно возрастает при заболеваниях поджелудочной железы. При остром панкреатите активность фермента в крови и моче увеличивается в 10—40 раз. Гиперамилаземия наступает при начале заболевания, достигает максимума через 12—24 ч после развития, затем быстро снижается и приходит к норме на 2-6-е сут.

Активность фермента может быть повышена при ряде заболеваний, имею­щих сходную клиническую картину с острым панкреатитом, а именно: остром аппендиците, перитоните, перфоративной язве желудка и двенадцатиперстной кишки. У больных с перитонитом увеличение амилазной активности является следствием развития образующих амилазу бактерий. Обычно активность фермента при указанных патологических состояниях повышается в 3—5 раз.

К заболеваниям, вызывающим сравнительно незначительную гиперамилаземию непанкреатического происхождения (т.е. без непосредственного по­ражения самой поджелудочной железы), относят холецистит, холелитиаз, со­стояние, связанное с разрывом желчного пузыря, заболевания почек, почечную не­достаточность, метастазирование раковой опухоли в легкие, поражение слюн­ных желез с обтурацией их протоков (ясная клиническая картина паротита поз­воляет легко объяснить гиперамилаземию), простатит, черепно-мозговую трав­му, травматический шок, ожоги, пневмонии, диабетический кетоацидоз, преры­вание беременности, послеоперационный период.

Активность альфа-амилазы в сыворотке крови повышается также при пер­форации пищевода, язве желудка, гастрите, острой кишечной непроходимости, ишемии и инфаркте тонкой кишки, перитоните, разрыве трубы при внематоч­ной беременности, сальпингите, аневризме аорты.

Основными причинами гиперамилаземии являются: нарушение оттока се­кретов из желез (продуцентов альфа-амилазы), повышение проницаемости гистогематического барьера в железах, некрозы ткани, нарушение выделения фермента через почечный фильтр.

Гиперамилаземию вызывают некоторые другие гормоны и многие фармако­логические препараты, в основном средства, приводящие к сокращению сфинктера Одди: адреналин, гистамин, секретин, фуросемид, салицилаты, ан­тикоагулянты, морфин, пантопон, опий, кодеин, тетрациклин, а также алко­голь.

Несмотря на то, что гиперамилаземия почти постоянно сопровождаетсяги-перамилазурией, определение активности альфа-амилазы мочи не всегда может служить точным показателем диагностики, так как выход амилазы в мочу связан с функцией почек. К тому же почки выделяют из крови только 24% секретированной пищеварительными железами амилазы.

Исследование активности альфа-амилазы в суточной моче — более надеж­ный биохимический тест выявления заболевания поджелудочной железы, чем исследование, базирующееся на анализировании разовой ее порции. После того как активность альфа-амилазы крови после приступа панкреатита воз­вратится к норме, она может оставаться повышенной в моче до 7 сут.

Коэффици­ент «активность альфа-амилазы крови/активность альфа-амилазы мочи» слу­жит показателем функциональной полноценности почечного фильтра.

Гипоамилаземчя в клинической практике встречается редко. Она отмечает­ся у больных с заболеваниями печени (гепатитами, циррозами), злокачествен­ными опухолями (особенно при наличии метастазов в печень), обширными ожогами, кожи, сахарным диабетом, гипотиреозом, общим расстройством пи­тания, падением массы тела, кахексией, а также под влиянием интоксикации (например, при токсикозе беременных). Снижение активности альфа-амила-зы чаще всего свидетельствует о недостаточности экзокринной функции под-желудочной железы. К уменьшению активности фермента приводит введение в организм цитратов и оксалатов.

Определение общей активности лактатдегидрогеназы

Лактатдегидрогеназа (L-лактат; НАД-оксидоредуктаза,КФ 1.1.1.27) — гликолитический (цитозольный цинксодержащий) фермент (молекулярная масса 135 000 Д), обратимо катализирующий окисление L-лактата в пировиноградную кислоту. Непременный участник данной реакции — окисленный никотинадениндинуклеотид, используемый в качестве кофактора фермента, играю­щего роль акцептора водорода.

Реакция, катализируемая лактатдегидрогеназой, может быть представлена в следующем виде:

СНзСНОНСОО"+НАД+ Лактатдегидрогеназа СНзСОСОО'+НАД • Н+Н+

L-лактат пируват

Фермент широко распространен в организме человека. По степени убыва­ния активности энзима органы и ткани могут быть расположены в следующем порядке: почки, сердце, скелетные мышцы, поджелудочная железа, селезенка, печень, легкие, сыворотка крови. В последней обнаружено несколько различ­ных белков (изоэнзимов), обладающих каталитическими свойствами этого фермента. Изменения в строении белковой части изоферментов обусловлива­ют их различные физико-химические свойства (в частности, неодинаковую электрофоретическую подвижность в агаровом, крахмальном, полиакриламид-ном и других гелях).

В плазме (сыворотке) крови выявлено пять изоэнзимов лактат-дегидроге-назы – ЛДГ1, ЛДГ2, ЛДГз, ЛДГ4, ЛДГ5, - располагающихся в геле в порядке убывания их электрофоретической подвижности.

Каждый из изоэнзимов представляет собой тетрамер, образованный субъ­единицами Н и М. Установлено, что фракция ЛДГ1 происходит в основном из ткани сердца, ЛДГ5 — из печени. ЛДГ в цитоплазме клеток и сыворотке крови представлена 5 изоферментами.

Субъединица М обнаруживается главным образом в тканях с анаэробным метаболизмом, в то время как субьединица Н присутствует в тканях с преобла­данием аэробных процессов. Методом электрофореза на носителях удается разделить все 5 изоферментов ЛДГ, которые в сыворотке крови здоровых людей представительству­ют в следующем процентном отношении: ЛДГ; (14—26%), ЛДГ^ (29—39%), ЛДГз (20-26%), ЛДГ4 (8-16%), ЛДГз (6-16%) - В.Н.Титов с соавт. (1988).

Лактатдегидрогеназа содержится не только в плазме, но и в значительном количестве в эритроцитах крови, поэтому сыворотка, используемая для анали­за, должна быть свежей, без следов гемолиза.

Методы определения общей активности ЛДГ подразделяются на две ос­новные группы: 1) кинетические, базирующиеся на оптическом тесте Варбур-га (оптическом эффекте, связанном с превращением НАД в НАД • Н, и на­оборот) и 2) методы, в которых определяется количество образовавшегося продукта или потребляемого субстрата после фиксированного инкубационно­го периода (методы конечной точки).

Работа №32 Колориметрический динитрофенилгидразиновый метод определения активности лактатдегидрогеназы в сыворотке крови (по Севелу и Товареку)

Принцип метода. L-лактат в щелочной среде в присутствии ЛДГ сыворот­ки и добавленного НАД окисляется в пируват. По степени его образования и судят об активности фермента.

Реактивы

1. 0,45 моль/л раствора молочнокислого натрия. В мерную колбу емкостью 100 мл вносят 5 мл молочной кислоты концентрации 800 г/л ийи 10 мл молочной кислоты концентрации 400 г/л и нейтрализуют ее 2 н раствором едкого натра до слабощелочной реакции с рН 7,5 (при пользовании фенолфталеином должна развиться слабо-розовая окраска). Объо м дово­дят дистиллированной водой до метки.

2. 0,03 моль/л раствора пирофосфорнокислого натрия, рН 8,8. В мерную колбу емкостью 500 мл вносят 6,69 г Na₂ Р₂O₅ • Н₂О, 50 мл диет» ллиро-ванной воды, смесь тщательно перемешивают и устанавливают) рН раствора 8,8 с помощью 1 н раствора НС1. Объем содержимого колбы дово­дят до метки дистиллированной водой. Реактив стабилен в течение ме­сяца при хранении в холодильнике.

3. Раствор НАД. 3 мг НАД (х. ч.) растворяют в 1 мл дистиллированной во­ды (из расчета 0,6 мг на пробу). Реактив стабилен 4 нед при хранении в холодильнике.

4. Раствор 2,4-динитрофенилгидразина. 19,8 мг 2,4-динитрофенилгидра-зина растворяют в небольшом объеме 1 н раствора соляной кислоты при нагревании смеси на водяной бане. После охлаждения доводят объем 1 н раствором соляной кислоты до 100 мл. На следующий день ре­актив фильтруют. Раствор хранят в посуде из темного стекла, он годен к употреблению в течение года.

5. 0,4 н раствор едкого натра.

6. 1 н раствор соляной кислоты.

7. Стандартный раствор пировинограднокислого натрия. 11 мг кристалличес­кого пировинограднокислого натрия растворяют в небольшом количестве дистиллированной воды, переносят в мерную колбу емкостью 100 мл и доливают объем раствора до метки дистиллированной водой. 1 мл раствор содержит 110 мкг пирувата натрия, что соответствует 88 мкг пировиноградной кислоты. Рабочий стандартный раствор готовят разведением основного в 10 раз дистиллированной водой. В 1 мл рабочего раствора 8,8 мкг пировиноградной кислоты.

Ход определения. 0,1 мл сыворотки, разведенной 1:2, смешивают с 0,3 мл раствора НАД и прогревают 5 мин при 37° С. Затем добавляют 0,8 мл раствора пи фосфорнокислого нагрия и 0,2 мл раствора молочнокислого натрия, предварительно прогретых при 37°С. Смесь инкубируют при 37°С в течение 15 мин час же после инкубации в пробу доливают 0,5 мл раствора 2,4-динитpoфeнилгидразина и выдерживают ее 20 мин при комнатной температуре. Затем вносят 5мл раствора едкого натра, содержимое пробирки перемешивают и через 10 мин

измеряют абсорбцию в области длин волн 500—560 нм, например на ФЭКе с зеле­ным светофильтром в кювете с толщиной слоя 10 мм. Регистрируют показатели оптической плотности исследуемой пробы, учитывая абсорбцию контрольной.

Контрольную пробу ставят так же, как опытную, но разведенную 1:2 сыво­ротку добавляют после инкубации смеси. Рассчитывают активность фермента по калибровочному графику. Активность лактатдегидрогеназы выражают в ммоль пировиноградной кислоты, образовавшейся при инкубации 1 л сыво­ротки в течение 1 ч при 37°С.

Чтобы получить данные для построения калибровочного графика, необхо­димо сделать следующее. Из рабочего стандартного раствора пировиноград­нокислого натрия приготовить ряд разведений (табл.2). Затем в пробирки прилить по 0,5 мл раствора 2,4-динитрофенилгидразина. Далее стандартные пробы обработать так же, как опытные.

При постановке контрольной пробы в пробирку вносят 0,6 мл дистиллиро­ванной воды, 0,8 мл раствора пирофосфата и 0,5 мл раствора 2,4-динитрофе­нилгидразина. Далее пробу обрабатывают аналогично опытной.

Для нахождения показателей активности лактатдегидрогеназы в размерности «ммоль пировиноградной кислоты на 1 л сыворотки за 1 ч инкубации при 37°С» количество мкмоль пировиноградной кислоты в стандартной пробе умножают на коэффициент 120 или количество мкг пировиноградной кислоты — на 1,41.

Для выражения активности фермента в единицах новой размерности мож­но применять и другую формулу:

Активность лактатдегидрогеназы в ммоль/(ч • л) = С • 120: 88,

где С — количество мкг пировиноградной кислоты в пробе, 120 — коэффи­циент пересчета мкг пировиноградной кислоты в мг, 88 — фактор пересчета показателей из «мг» в ммоль.

При построении калибровочного графика на оси абсцисс откладывают значения активности фермента, выраженные в размерности, ммольДч • л) и представленные в последней графе таблице 33. Прямолинейная зависимость между концентрацией пировиноградной кислоты и оптической плотностью сохраняется от 0 до 10 ммоль/(ч • л).

Таблица 2

Данные к построению калибровочного графика

Рабочий андарт- ный раствор пирувата, мл	Раствор пи­ рофосфорно­ кислого на­- трия, мл	Дистил­- лирован-­ ная вода, мл	Содержание пировиноградной кислоты в стандартной пробе	Активность ЛДГ: ммоль пировино­ градной кислоты на 1 л сыворотки за 1 ч инкубации
мкг	мкмоль
0,1	0,8	0,5	0,88	0,01	1,2
0,2	0,8	0,4	1,76	0,02	2,4
0,4	0,8	0,2	3,52	0,04	4,8
0,6	0,8	—	5,28	0,06	7,2
0,8	0,6	-	7,04	0,08	9,6

Нормальные величины активности общей ЛДГ в сыворотке крови — от 0 8 до

4 ммоль/(ч • л).

Примечания.

1. Сыворотка крови не должна быть гемолизирована.

2. Для исследования лучше использовать свежую сыворотку.

3. Щавелевоуксусную плазму употреблять не рекомендуется, так как соли щавелевой кислоты ингибируют фермент.

Пользуясь данным методом, можно исследовать имочевина-стабильную фракцию ЛДГ.

Принцип метода основывается на свойстве мочевины почти на 100% инги-бировать активность ЛДГз. При параллельном определении активности общей ЛДГ рассчитывают процент содержания стабильной к мочевине фракции.

Реактивы. Те же, что и в предыдущем методе. Дополнительно используют раствор мочевины, приготовленный на 0,03 моль/л раствора пирофосфорно-кислого натрия (14,4 г мочевины вносят в 100 мл раствора пирофосфорнокис-лого натрия, рН 8,8).

Ход определения активности общей и мочевиностабильной фракции ЛДГ отличается такими особенностями:

1. В методике исследования активности мочевиностабильной фракции ЛДГ применяется раствор пирофосфата натрия, содержащий мочевину

2. При выполнении первого этапа метода 0,1 мл сыворотки, разведенной 1:2, тщательно смешивают с 0,08 мл раствора пирофосфорнокислого на­трия,содержащего мочевину, и с 0,3 мл раствора НАД. Преинкубацию проводят в течение 1 ч при + 25°С, закрыв пробирку крышкой. Затем в пробирку добавляют 0,2 мл раствора молочной кислоты и инкубиру смесь 15 мин при +37°С.

3.В методике определения общей активности ЛДГисключают этап пр варительного прогревания раствора при температуре 37°С и после сливания реактивов комнатной температуры сразу же приступают к инкубации смеси в течение 15 мин при температуре 37°С.

В остальном метод не отличается от описанного выше. Расчет сводите установлению процентного содержания мочевиностабильной ЛДГ по отношению к общей.

В нормемочевиностабильная ЛДГ состава 25-36% от общей ЛДГ.