Теоретические основы спектрофотометрического анализа

Изучение веществ по их спектрам поглощениям считают в настоящее время одним из наиболее распространенных методов исследования. Применение его в биологии значительно облегчает наблюдение за ходом превращений химических соединений непосредственно в клетках и тканях, не нарушая их целостности. Так как поглощение света связано с векторными переходами между энергетическими уровнями в молекулах, определение спектров поглощения позволяет судить о строении молекул, состоянии веществ в биологических структурах и их ближайшем окружении.

Принцип спектрофотометрического анализа основан на свойстве вещества поглощать свет определенных длин волн, характерных для данного типа соединений. Процесс поглощения кванта света молекулой вещества можно схематически представить в виде перехода молекулы из основного невозбужденного (синглетного) состояния (S₀) в одно из возможных возбужденных с более высоким уровнем энергии состояний (S₁ илиS₂), причем энергия поглощенного кванта света будет равна разности уровней возбужденного и основного состояний молекулы (рис. 1). На рисунке такой переход обозначен стрелкой, длина которой равна энергии кванта света E=hv (h – постоянная Планка; v – частота световой волны). Поскольку возбужденные состояния молекул различаются по энергиям, возможны различные переходы молекул из основного в возбужденные уровни. Из квантов света с различными энергиями могут поглощаться только те, у которых энергия E=hν будет соответствовать энергиям пореходов между какой-либо парой уровней в молекуле данного вещества.

Участие атомов, составляющих сложные органические молекулы, в колебательном и вращательном движении наряду с указанными электронными уровнями вызывает появление множества подуровней. В соответствии с этим при поглощении света сложными молекулами возбуждаются многие электронно-колебательные переходы. Вместе с поглощением молекулой квантов с частотой v₀ (чисто электронный переход 0 - 0) будут поглощаться кванты с близкими значениями частот (0 – 1, 0 – 2 и т.д.), и поглощение определится в некотором диапазоне частот около v₀. поэтому в отличие от линейных спектров атомов для сложных молекул обычно характерны широкополосные спектры.

Рис. 1. Переходы между энергетическими уровнями при поглощении света.

Интенсивность полос поглощения определяется вероятностью перехода молекул из основного состояния в данное возбужденное. Зависимость вероятности поглощения от частоты или длины волны света называется спектром поглощения. Длинна световой волны и ее частота связаны соотношением λ = , где λ – длина волны; v – частота; c – скорость света. Для изменения спектров поглощения необходимо источники света с непрерывным спектром излучения, так как необходим весь набор длин волн света в интересующей нас области (в ультрафиолетовой области используется водородная лампа, в видимом – лампа накаливания).

Практически определение спектров поглощения сводится к оценке доли излучения, поглощенной в объеме определенной толщи для разных длин волн. В качестве примера возьмем кювету с раствором какого-либо окрашенного вещества известной концентрации С. Толщина кюветы – I. Предположим, на кювету падает монохроматический свет луч интенсивностью I₀, а интенсивность луча, прошедшего через кювету и найденного с помощью фотоприемника, равна I. Отношение интенсивностей прошедшего и падающего излучения называется пропусканием и обозначается Т. Т = ; Т = 100%. Величина Т измеряется в долях единицы или в процентах. Отношение интенсивности света, поглощенного образцом (I₀ - I), к интенсивности падающего на кювету называется поглощением: = . Как видно из определения, величины пропускания (Т) и поглощения (1 - T) изменяются от 0 до 1 (от 0 до 100%).

В общем случае поглощение (I - T) не пропорционально концентрации вещества, поэтому для ее определения используют другой показатель – оптическую плотность: D = . Связь между оптической плотностью и концентрацией вещества описывается законом Ламберта-Бера: , где С – концентрация вещества, моль/л; I – толщина кюветы, см; Е – молярный коэффициент поглощения (коэффициент экстинкции). Из определения оптической плотности видно, что . Из формулы следует, что значения Т находятся в пределах 1 – 0, величина же D может изменяться от 0 до бесконечности. Как видно, закон Ламберта-Бера отражает линейную закономерность оптической плотности D от концентрации С прямая линия в координатах D = f(C), тангенс угла ее наклона равен Е₁.

Так как оптическая плотность – величина безразмерная, то коэффициент молярной экстинкции будет иметь размерность л/моль∙см. Условно Е представляет оптическую плотность образца в кювете толщиной 1см при концентрации 1 моль/л. Этот коэффициент и определяет поглотительную способность того или иного вида молекул и ее зависимость от длины волны света, т.е. спектр поглощения . Спектр поглощения является «паспортом» вещества, благодаря которому возможна идентификация соединений. Наряду со шкалой длин волн в нанометрах (1 нм = 10^-9м) используется шкала частот в «волновых числах».

Существует несколько видов записи спектров поглощения, выбор которых имеет немаловажное значение для исследования. Если необходимо знать относительное количество квантов, поглощенных образцом при разных длинах волн, то целесообразно использовать спектр (1-T) (обычно при фотохимических и фотобиологических исследованиях). Для определения концентрации вещества, оценки поглотительной способности молекул, их спектроскопических характеристик обычно находят спектр D, поскольку форма последнего не зависит от концентрации. Спектры поглощения D и (1-T) совпадают по форме только при малом поглощении, т.е. для низких концентраций вещества в этом случае (1-T) – 2,3D, что можно показать, разлагая в ряд функцию (1 – 10^-D) при малых D.

Наиболее важными параметрами спектров поглощения служат положения максимумов спектра на шкале длин волн (λ макс.нм или V макс.см^-1), полуширина полос поглощения ∆1/2 (измеряются на половине высоты максимума), величины максимумов D макс., а если их несколько, то и соотношение между ними.

Форма спектра поглощения зависит не только от типа вещества, но и от его состояния, характера молекулярного окружения (например растворителя). Восстановление, окисление молекул, их агрегация, комплексообразование, водородные связи, изомеризация, измерение полярности (гидрофобности) окружения – все эти факторы существенно сказываются на спектрах поглощения, что позволяет, исходя из изменения спектров, делать определенные выводы о характере состояния исследуемых веществ, конформации молекул и т.д.

Как видно из сказанного выше, по измеренной на спектрофотометре оптической плотности при известных Е и l можно вычислить концентрацию вещества . Обычно оптическую плотность измеряют при длине волны, соответствующей максимуму поглощения. Наибольшая точность достигается при оптической плотности 0,43.

Если в исследуемом объеме имеется несколько веществ, поглощающих свет в одной и той же спектральной области, то для каждой длины волны D_AB = D_A+ D_B для пропускания – Т_АВ = Т_А ∙ Т_В, где D_A и D_B – оптические плотности для веществ А и В смеси, а D_АВ – оптическая плотность смеси при данной длине волны (аналогично для Т).

Существует целая группа фотобиологических процессов, смысл которых заключается в синтезе биологически важных соединений за счет поглощения организмом солнечной энергии. К ним относится фотосинтез у зеленых растений, бактерий и водорослей. Фотосинтез – единственный биологический процесс, в ходе которого происходит увеличение свободной энергии системы (около 502 Дж). Все другие осуществляются за счет потенциальной энергии, накапливаемой в фотосинтезирующих организмах при поглощении квантов излучения.

Хлорофиллы и каротиноиды служат важнейшими компонентами фотосинтетического аппарата, при помощи которого растения улавливают лучистую энергию и преобразовывают ее в химическую. Для каждого вида растений характерен свой пигментный состав. От состояния пигментов и их состава зависит полнота улавливания солнечной энергии. Поэтому, изучив физико-химические свойства пигмента, можно судить о фотосинтезирующей способности растения.

Синий максимум в абсорбционном спектре хлорофиллов проявляется благодаря замкнутой системе конъюгированных связей в молекуле хлорофилла. Положение красного максимума вызвано гидрированием связи меду атомами углерода в положениях 7 и 8. Атом магния в молекуле хлорофилла усиливает поглощение в красной области спектра и снижает – в зеленой. Присутствие в молекуле каротиноидов большого количества конъюгированных связей объясняет поглощение ими сине-фиолетовых лучей. Необходимо отметить, что максимум поглощения пигментов в живых тканях сдвинут в длинноволновую сторону. Величина сдвигов зависит от состояния пигментов – степени агрегации молекул и связи их с белками. Определение оптических свойств пигментов составляет основу качественного количественного анализов этих соединений.