Среды для выявления и идентификации энтеробактерий

Питательные среды

Известно очень много питательных сред для культивирования микроорганизмов (более двух тысяч наименований было классифи­цировано Левином и Шенлейном еще в 1930 г.), но число ингредиентов, являющихся их неотъемлемыми компонентами, отно­сительно невелико. Однако качественный диапазон этих сред весьма широк — от растворов неорганических солей, на которых могут расти автотрофы, до сложных питательных сред, приготавливаемых из мясных гидролизатов, обогащенных кровью или сывороткой; ими обычно пользуются для выделения патогенных микроорганиз­мов типа стрептококков, отличающихся высокой требовательностью к составу питательной среды. Различают два основных типа пита­тельных сред: так называемые синтетические среды, главные состав­ные части которых точно известны (например, глюкозо-солевая питательная среда), и эмпирически подобранные питательные среды природного происхождения, состав которых точно неизве­стен (к ним относятся пептоны, приготавливаемые из частично гидролизованного белка).

Выбор питательной среды зависит в значительной степени от цели эксперимента. Герберт настойчиво высказывался за по­всеместное использование синтетических питательных сред. Однако следует признать, что они обладают рядом практических неудобств. Микроорганизмы, выращенные на таких питательных средах, обычно фенотипически отличаются от выращенных на питательных средах естественного происхождения типа бульона (например, по составу и по скорости деления). Размножение микроорганизмов на таких средах обычно легче подавляется избыточной аэрацией или токсическими катионами; они также более чувствительны к нарушениям баланса между некоторыми составными частями питательной среды, особенно аминокислотами. Многие бактерии нуждаются в большом числе факторов роста, и для некоторых из них до сих пор не найдены искусственные среды, на которых они могли бы размножаться. Возможно, что все эти неудобства со временем будут преодолены, но пока среды неизвестного состава ти­па бульонов, приготовленных из перевара, используются весьма ши­роко, хотя они и вносят в эксперимент неконтролируемые факторы.

В литературе опубликованы результаты количественных анали­зов многих питательных сред природного происхождения, что является определенным шагом на пути к их стандартизации. Однако данными этих анализов следует пользоваться с осторожностью, поскольку результаты определений, проведенных независимо друг от друга, демонстрируют существенные различия состава различ­ных партий одной и той же питательной среды. Более того, при проведении анализов обычно игнорируется наличие в питательных средах многих существенно важных составных частей, хотя ясно, что компоненты, требуемые в следовых количе­ствах, например витамины и катионы, могут присутствовать в исклю­чительно малой концентрации. При этом может оказаться, что размножение бактерий идет нормально, тогда как про­цессы типа споруляции или адсорбции фага ингибируются.

В состав сред, применяемых для выращивания бакте­рий, входят необходимые для построения белков цитоплазмы элементы: азот, углерод, водород, кислород, неорганиче­ские соединения, содержащие фосфор, калий, серу, натрий, магний, железо, микроэлементы: кобальт, йод, марганец, бор, цинк, молибден, медь и др. Все перечисленные элементы должны находиться в питательной среде в удобоусвояемом для данного микроорганизма соединении, причем требования различных микробов в этом отношении неодинаковы. Потреб­ность в кислороде и водороде бактерии удовлетворяют глав­ным образом за счет поступающей в клетку воды.

По характеру усвоения азота патогенные микроорганиз­мы делятся следующим образом: одни из них извлекают азот из простых аммонийных соединений, другие нуждаются в аминокислотах, третьи расщепляют высокомолекулярные вещества — пептоны, представляющие собой продукты непол­ного ферментативного переваривания белков. Строго пара­зитические виды бактерий размножаются только в присут­ствии нативного, т. е. неизмененного, белка.

Источником углерода для патогенных бактерий являются, главным образом, различные углеводы: сахар, многоатомные спирты, органические кислоты и их соли.

Потребность бактерий в неорганических элементах удов­летворяется прибавляемыми к питательной среде солями: NaCI, KH₂PO₄, K₂HPO₄ и т. д. Микроэлементы, выполняющие роль катализаторов химических процессов, необходимы в ничтож­но малых количествах и поступают в питательную среду с пептоном, неорганическими солями и водой.

Наряду с перечисленными органическими и неорганиче­скими элементами бактерии нуждаются в ростовых факторах, которые по своей роли соответствуют витаминам для живот­ных. Источником факторов роста являются прибавляемые к питательной среде продукты растительного и животного про­исхождения, содержащие в своем составе никотиновую, пантотеновую, парабензойную кислоты, витамины А, В, С и др.

Питательные вещества могут усваиваться микробами только при определенной реакции питательной среды, так как проницаемость оболочек микробных клеток изменяется в зависимости от рН среды.

Потребность в питательных веществах и физических усло­виях у различных видов микробов неодинакова и этим ис­ключается возможность создания универсальной питательной среды.

По консистенции различают плотные и жидкие пи­тательные среды. Плотные питательные среды готовят из жидких посредством прибавления к ним клеевых веществ - агара или желатина. Агар-агар (по малайски – желе) — про­дукт растительного происхождения, добываемый из морских водорослей. В воде агар-агар растворяется при температуре 80—86°С, застудневает при 36—40°С. Применение агаровых сред благодаря их способности сохранять плотность при тем­пературе 37°С дало возможность выращивать патогенные микробы при оптимальной для большинства из них темпера­туре на плотных средах. Желатин — вещество белковой при­роды животного происхождения. В теплой воде при темпера­туре 32—34°С он набухает и растворяется, а при более низ­кой температуре превращается в студень. Однако при рН ниже 6,3 и выше 7,0 плотность желатина уменьшается, и он плохо застывает.

Исходные продукты для приготовления пи­тательных сред. Для приготовления питательных сред используют:

- Продукты животного происхождения (мясо, рыба, ка­зеин, молоко, яйца, кровь и т. д.).

- Продукты растительного происхождения (картофель и др.).

- Органические и неорганические соединения определен­ного химического состава.

Питательные среды, приготовленные из продуктов расти­тельного и животного происхождения, несмотря на то, что они не могут быть стандартны и не имеют определенного химического состава, находят широкое применение в прак­тике микробиологии. Синтетические питательные среды, со­ставленные из химических соединений, используют пре­имущественно для изучения обмена веществ микробной клетки.

^ Требования, предъявляемые к питатель­ным средам. Питательные среды должны:

Содержать необходимые для питания микроба питательные вещества.

Иметь реакцию рН, оптимальную для выращиваемого вида микроба.

Иметь достаточную влажность, так как микробы пита­ются по законам диффузии и осмоса.

Обладать изотоничностью.

Быть стерильными, обеспечивая тем самым возмож­ность выращивания чистых культур микробов.

Питательные среды подразделяются на среды общего назначения и специальные.

К первой группе отно­сятся мясо-пептонные: агар, бульон, питательный желатин. Среды общего назначения используют для выращивания мно­гих патогенных микробов и применяют в качестве основы для приготовления специальных сред, добавляя к ним кровь, сахар, молоко, сыворотку и другие ингредиенты, необходи­мые для размножения того или иного вида микроба.

К специальным питательным средам относятся электив­ные (избирательные) и дифференциально-диагностические.

Элективные (избирательные) среды. Принцип создания элективных питательных сред основан на удовлетворении ос­новных биохимических и энергетических потребностей того вида микроба, для культивирования которого они предназначены. Определенный состав и концентрация питательных микроэлементов, ростовых факторов при строгом значении рН обеспечивают оптимальные условия для выращивания одного или нескольких видов микроорганизмов. При посеве на них материала, содержащего смесь раз­личных микроорганизмов, раньше всего будет проявлять­ся рост того вида, для которого данная среда будет электив­ной.

Дифференциально-диагностические питательные среды. Дифференциально-диагностиче­ские питательные среды ис­пользуют для определения видовой принадлежности иссле­дуемого микроба, основываясь на особенностях его обмена веществ. По своему назначению дифференциально-диагности­ческие питательные среды подразделяются следующим об­разом:

Среды для выявления протеолитической и гемолитической способности микробов, содержащие в своем составе бел­ковые вещества: кровь, молоко, желатин, свернутую кровя­ную сыворотку и т. д.

Среды с индифферентными химическими веществами, которые служат источником питания для одних видов микро­бов и не усваиваются другими видами.

Среды с углеводами и многоатомными спиртами для обнаружения соответствующих ферментов.

Среды для определения редуцирующей способности микробов.

В состав дифференциально-диагностических сред, пред­назначенных для выявления сахаролитических и окислитель­но-восстановительных ферментов, вводят индикаторы: ней­тральный красный, метиленовый синий, лакмусовую настой­ку, кислый фуксин, бромтимоловый синий, водный голубой краситель и розоловую кислоту. Изменяя свою окраску при различных значениях рН, индикатор указывает на нали­чие или отсутствие расщепления, окисления или восстанов­ления введенного в среду ингредиента. Однако индикатор не является обязательной составной частью сред, предназначен­ных для выявления ферментов. Так, наличие желатиназы и других протеолитических ферментов в культуре определяют по разжижению желатина, свернутого яичного или сыворо­точного белка.

Сухие питательные среды. Приготовление питательных сред — один из наиболее ответственных и трудных участков работы бактериологической лаборатории. В связи с этим биопромышленность выпускает стандартные, консервированные, сухие питательные среды, различного назначения, для культивирования микроорганизмов.

Приготовление обычных питательных сред. Основой для приготовления этих сред служит мясная вода, содержащая экстрактивные вещества.

Посуда. Питательные среды готовят в кастрюлях, эмалированных или из нержавеющей стали. Готовые питательные среды разливают во флаконы, пробирки, чашки.

Новую стеклянную посуду кипятят в 1—2% растворе соляной кис­лоты для нейтрализации растворимой щелочи, затем тщательно промывают в проточной воде и сушат. Посуду, бывшую в употреблении, стерилизуют, затем моют, прополаскивают и сушат. Сухие флаконы, колбы, пробирки закрывают ватно-марлевыми пробками.

Практическая работа

Среды для выявления и идентификации энтеробактерий

Энтеробактерии (лат. Enterobacteriaceae) — бактерии группы кишечной палочки). Это семейство грамотрицательных палочкообразные, споро-необразующие бактерии, длиной 1-5 мкм, со жгутиками для передвижения. Эти бактерии — факультативные анаэробы, расщепляют углеводы с образованием муравьиной кислоты и других конечных продуктов ( так называемое формиатное брожение). Некоторые из них могут разлагать лактозу.Группа энтеробактерий включающая: сальмонеллы, шигеллы, эшерихии,клебсиеллы, собственно энтеробактер, серрации, протей, морганеллы, провиденции и иерсинии в норме обитают в желудочно-кишечном тракте человека и животных,но при снижении защитных свойств слизистой кишечника, могут вызывать инфекции желудочно-кишечного тракта или других органов. Кроме того, энтеробактерии обитают в почве, воде или паразитируют на растения.

Escherichia coli – кишечная палочка, наиболее изученный представитель энтеробактерий, в норме определяется в желудочно-кишечном тракте и синтезирует секреторные иммуноглобулины и колицины. Они тормозят рост некоторых патогенных энтеробактерий и препятствуют проникновению их в слизистую оболочку стенки кишечника. E. сoli участвует синтезе витамина К (свертываемость). Некоторые патогенные штаммы кишечной палочки могут поражать слизистую кишечника, что проявляется кровавым водянистым поносом или диареей путешественников.

Для выявления энтеробактерий существуют как элективные, так и дифференциально-диагностические среды.

Элективные (избирательные) среды. Принцип создания элективных питательных сред основан на удовлетворении ос­новных биохимических и энергетических потребностей того вида микроба, для культивирования которого они предназначены. Определенный состав и концентрация питательных микроэлементов, ростовых факторов при строгом значении рН обеспечивают оптимальные условия для выращивания одного или нескольких видов микроорганизмов. При посеве на них материала, содержащего смесь раз­личных микроорганизмов, раньше всего будет проявлять­ся рост того вида, для которого данная среда будет электив­ной.

Дифференциально-диагностические питательные среды. Дифференциально-диагностиче­ские питательные среды ис­пользуют для определения видовой принадлежности иссле­дуемого микроба, основываясь на особенностях его обмена веществ.

Среда Левина (эозин-метиленблау агар) — цветная элективная питательная среда, применяемая для дифференцирования микроорганизмов кишечной группы при микробиологической диагностике кишечных инфекций — брюшного тифа, сальмонеллезов, дизентерии, колиэнтеритов. Наличие в среде лактозы позволяет выделять патогенную микрофлору, не способную разлагать этот углевод. Входящие в состав среды Левина органические красители задерживают рост сапрофитов.

Микроорганизмы, ферментирующие лактозу, образуют на среде колонии фиолетового цвета с металлическим блеском. Лактозоотрицательные энтеробактерии образуют прозрачные, бесцветные колонии. Стафилококки образуют на среде Левина -ГРМ мелкие колонии с темным центром.

Среда Кесслера (ГРМ) предназначена для обнаружения бактерий группы кишечной палочки по признаку ферментации лактозы. Кишечная палочка и клебсиелла вызывают помутнение среды и газообразование, у ентеробактера газообразование выражено слабо, псевдомонас только слабое помутнение среды, другие знтеробактерии не растут. Газообразование определяют с помощью поплавка – перевернутого сосудика, который всплывает при наличии газов. Среда Кесслера может быть как жидкой, так и твердой на основе агара.

Среда Кода также предназначена для выделения и дифференциации энтеробактерий по признаку ферментации лактозы. Признаком роста лактозоположительных энтеробактерий (БГКП) является изменение цвета среды с темно-зеленого до ярко-желтого; лактозоотрицательных энтеробактерий (шигелл, сальмонелл) – помутнение среды без изменения цвета.

Среда Эндо (фуксин-сульфитный агар)– плотная слабоселективная дифференциально-диагностическая среда для дифференциального определения и идентификации БГКП при контроле санитарного состояния производства и качества готового продукта на предприятиях пищевой промышленности.

По характеру колоний на среде Эндо судят о принадлежности микроорганизмов, давших рост на накопительных питательных средах, к лактозоположительным или лактозоотрицательным энтеробактериям.

Характерным ростом для БГКП является образование красных или темно-красных колоний с металлическим блеском.

Висмут-сульфит агар - строго селективная среда для выделения сальмонелл. Дифференцирующее действие среды основано на том, что образуемый бактериями из сульфата железа сероводород, вызывает почернение индикатора – цитрата висмута – вследствие перехода его в сульфид висмута, вещество черного цвета. Поэтому бактерии, образующие сероводород, формируют черные или черные с коричневым или темно-зеленым оттенком колонии, обладающие часто металлическим блеском. Среда под колониями, при этом, окрашена в черный цвет.

Наличие круглых, черных колоний, с блестящей зоной вокруг них, диаметром 1,0-3,0 мм; среда под колониями окрашивается в черный цвет - Salmonella typhi H, Salmonella typhimurium. Наличие круглых, зеленых, с темным центром колоний диаметром
1,0-2,5 мм. - Salmonella paratuphi, Наличие круглых, зеленовато-коричневых колоний, диаметром
0,5-1,5 мм. - Escherichia coli, Наличие круглых, светло-зеленого цвета колоний диаметром 1,0-2,0 мм. -Proteus vulgaris

Внешний вид колоний	Микроорганизмы
Черный центр, светлый край, окруженный преципитатом черного цвета с металлическим блеском	Salmonella (за исключением S.paratyphi и S.pullorum)
Мелкие, окрашенные в цвет от зеленого до коричневого, иногда мукоидные	Колиформные бактерии, Serratia,Proteus и др.

Агар Плоскирева — селективная среда для выделения шигелл и сальмонелл. Готовая среда прозрачна, имеет розовато-желтоватый цвет. Среда Плоскирева относится к плотным средам для выделения чистых культур.

В состав среды Плоскирева входят ингибирующие вещества (желчные соли, бриллиантовый зеленый, йод), вследствие чего она должна полностью подавлять рост грамположительной флоры, значительно задерживать (первые 24 ч) рост эшерихий и другой сопутствующей микрофлоры, подавлять роение протея.

Дифференцирующие свойства агара Плоскирева основаны на изменении рН в кислую сторону при росте лактозоферментирующих бактерий, которые образуют колонии брусничного цвета (индикатор нейтральный красный).

Лактозоотрицательные бактерии вырастают в виде бесцветных или слабоокрашенных колоний. Вегетирующие свойства среды недостаточны для роста Sh. dysenteriae и некоторых сальмонелл (S. cholerae-suis, S. pullorum).

Приготовление питательных сред

Среда Левина-ГРМ представляет собой гигроскопичный мелкодисперсный порошок светло-сиреневого цвета. Препарат в количестве 16 г размешивают в 1 л дистиллированной воды, доводят до кипения и кипятят 2-3 мин. Горячую среду фильтруют через ватно-марлевый фильтр. Среду стерилизуют автоклавированием при температуре 112 °С в течение 20 мин. Стерильную среду охлаждают до температуры 45-50 °С и разливают в стерильные чашки Петри.

Среда Кесслера-ГРМ представляет собой гигроскопичный мелкодисперсный порошок серо-желтого цвета. Препарат в количестве 23,0 г размешивают в 1 л дистиллированной воды, нагревают до кипения и кипятят в течение 2-3 мин. Горячую среду фильтруют через ватно-марлевый или бумажный фильтр и разливают по 5 мл в стерильные пробирки с поплавками. Среду в пробирках стерилизуют автоклавированием при температуре 112 °С в течение 20 мин. Готовая среда имеет фиолетовый цвет.

Среда Кода. Препарат в количестве 30 г размешивают в 1 л воды очищенной, кипятят 2 - 3 минуты до полного растворения компонентов, фильтруют через ватный фильтр, смоченный водой, доводят до кипения и разливают по 5 мл в стерильные пробирки. Готовая среда должна иметь зеленую окраску.

Висмут-сульфит агар. Препарат в количестве, необходимом для приготовления конкретной серии, тщательно размешивают в 1 л воды дистиллированной, кипятят при постоянном перемешивании в течение 3 мин до полного расплавления агара. Охлаждают до температуры 45-50 °С, взбалтывают, разливают в нестерильные чашки Петри слоем
4-5 мм и оставляют на рабочем столе с открытыми крышками для застывания и подсушивания среды в течение 90-100 мин при температуре 18-25°С.

Готовая среда в чашках непрозрачная зелено-желтого цвета.

Агар Плоскирева (не готовили) Размешать 63,0 г порошка М108 или 60,0 г порошка М108D или 57,0 г порошка М1032 в 1000 мл дистиллированной воды. Прокипятить с частым помешиванием для полного растворения частиц. НЕ АВТОКЛАВИРОВАТЬ И НЕ ДОПУСКАТЬ ПЕРЕГРЕВАНИЯ СРЕДЫ. Перегревание снижает селективные свойства среды. Остудить примерно до 50°С, перемешать и разлить в стерильные чашки Петри.

Материалы и оборудование: чашки Петри, пробирки с ватными пробками, ушные палочки, перчатки, электрическая плитка, микробиологическая петля, спиртовка, штатив для пробирок, автоклав

Задание

1. Приготовить питательные среды Кесслера, Кода, висмут-сульфит агар

2. Сделать посев микроорганизмов

3. Определить видовой состав энтеробактерий