Производные 1,4-бензодиазепина
Общие свойства веществ.
Распределение производных 1,4-бенздиазепина по органам происходит в три стадии:
· 1-ая характеризуется падением концентрации в крови и накоплением в паренхиматозных органах;
· на 2-ой стадии идет накопление соединений во всех органах. Предел накопления соединений в тканях определяется кажущимся объемом распределения (Vр);
· 3-я стадия, самая продолжительная по времени – характеризуется накоплением соединений в органах выделения (печени, почках), с одновременным уменьшением в остальных тканях органов.
Наибольшее содержание 1,4-бенздиазепинов в ЖКТ, тканях печени, почек.
Ультрафиолетовые спектры
В электронных спектрах производных 1,4-бенздиазепина имеется 3 полосы поглощения с λmax в областях:
1. 200-215 нм
2. 220-240 нм
3. 290-330 нм
Две первые полосы соответствуют возбуждению ароматических хромофоров. Третью длинноволновую полосу относят к азометиновой связи, сопряженной с бензогруппой.
По характеру поглощения в УФ-области 1,4-бенздиазепины относятся к соединениям, абсорбция которых изменяется от величины значений рН:
- в кислой среде – за счет протонирования атома азота 1 (у хлордиазепоксида) и 4 (1,2-дигидропроизводных 1,4-бенздиазепина – нитразепам, оксазепам, диазепам);
- в щелочной среде в молекуле 1,2-дигидропроизводных 1,4-бенздиазепина наблюдается изменение хромофорной системы (увеличение сопряжения за счет лактим-лактамной таутомерии азометиновой связи в положения 1,2 - нитразепам, оксазепам).
Кислотный гидролиз хлордиазепоксида (I), протекающий в мягких условиях, приводит к образованию 4-окси-1,2-дигидро-3Н-1,4-бенздиазепин-2-онов (II). В более жестких условиях эти соединения гидролизуются до 2-аминобензофенонов (III), альфа-аминокислот (IV) и аминов (V).
Метаболизм
Окисление
1.1. N-деметилирование
1. В молекуле диазепама у атома азота в 1 положении
2. В метиламинной группе хлордиазепоксида
Пробоподготовка.
Изолирование из тканей и органов трупа.
Анализ производных 1.4-бензодиазепина по нативным соединениям.
Возможно использование любых общих методов пробоподготовки.
· М-д изолирования нейтральным ацетоном
Биоматериал + н-ацетон à ацетоновое извлечение + 0,5н HCL + н-гексан à очищенная ацетоно-водная вытяжка àацетоно-водная фаза + NaOH + эфир à эфирное извлечение à ТСХ, элюирование à исследование не бензодиазепины.
· М-д Васильевой
Биоматериал + вода, подкисленная органической кислотой à водная вытяжка à водная фаза + NH4OH + хлороформ à органическая фаза à выпаривание à исследование на бензодиазепины
· М-д Стаса-Отто
Биоматериал + 96% этанол + органическая кислота à спиртовой экстракт à упаривание + 100% спирт à отделение осадка à очищенный экстракт à упаривание à остаток + горячая вода à фильтрование à водная фаза + NaOH + хлороформ à органическая фаза à исследование на бензодиазепины
ТСХ-скрининг
1. Общая система
НФ: силуфол
ПФ: хлороформ:этилацетат
Д:
· Р-в Драгендорфа
· Р-р FeCl3 + HCl + HNO3
2. Частная система
НФ: силуфол
ПФ: хлороформ:этилацетат:метанол
Д:
· Р-в Драгендорфа
· Р-р FeCl3 + HCl + HNO3
Обнаружение:
а) реактив Драгендорфав разбавленной уксусной кислоте образует оранжевые и желто-оранжевые комплексные соли;
б) реактив FPN(хлорид железа (III) в смеси хлорной и азотной кислот) окисляет бензодиазепины с образованием окрашенных продуктов желтогоцвета;
в) реактив Маркиобразует окрашенные продукты желтогоцвета;
г) подкисленный йодплатинатобразует темноокрашенные пятна.
Количественное определение
Для ГЖХобнаружения производных 1,4-бензодиазепина и ихметаболитов используется общая система: стеклянная колонка 2 м х 4мм с 2,5% SE-30 на хромосорбе Q.
Газ-носитель – аргон/метан
Температура колонки от 150 до 300 С
Температура инжектора – 230
Температура детектора - 300
Подготовка пробы: кровь/моча + вода + р-р NaHCO3 à центрифугирование à центрифугат à ТФЭ + вода à промывают картридж хлороформом à остаток растворяют в метаноле.
ГХ/МС анализ
Газовый хроматограф/ масс-спектрометр
Стандарты: смесь бензодиазепинов
Экстракция: пробирка + биожидкость + стандарт à встряхивают + NaCl + NH4Cl + н-бутилхлорид à экстракция à центрифугирование à органический слой + ацетонитрил + гексан à выпаривание à + этиловый эфир + KOH à центрифугирование à анализ
ВЭЖХ -анализ
Условия хроматографирования:
• хроматограф жидкостный
• ПФ: ацетонитрил:ацетатный буфер
• скорость потока элюирования - 100 мкл/мин
• детектирование - при длине волны 240 нм.
Подготовка пробы: моча + ацетат Na + b-глюкуронидаза à настаивание 2 часа + ацетатный буфер.
Приготовление стандартных образцов.
Для приготовления эталонных растворов используется чистые субстанции. Эти растворы служат для идентификации указанных веществ, определения их хроматографических параметров, а также для приготовления контрольных растворов при проведении количественных анализов.
Качественный анализ.
Идентификация проводится следующим образом:
• сопоставляют время удерживания и коэффициент емкости определяемого компонента и образца сравнения;
• сравнивают УФ-спектры предполагаемого компонента и образца сравнения;
• оценивают совпадение значений времени удерживания определяемого
компонента и образца сравнения при добавлении контрольного раствора в
раствор экстракта из биопробы (причем концентрация образца сравнения
должна быть близка к концентрации определяемого компонента);
• сопоставляют УФ-спектры определяемого компонента и образца сравнения при двух длинах волн, и оценивается их спектральное отношение.
Концентрация определяемого вещества (Ci) в растворе экстракта из биопробы определяется по формуле
где
Ck - концентрация "добавки" в растворе подвижной фазы;
Vk - объем добавленного контрольного раствора;
Vi- объем раствора экстракта с определяемым веществом;
hi - высота сигнала определяемого вещества в растворе экстракта из биопробы;
hi+k - высота сиrnала определяемого вещества после добавки в раствор экстракта
контрольного раствора.
Метод внешнего стандарта
В соответствии с методом внешнего стандарта и с учетом линейности зависимости выходного сигнала от массы вещества последовательно, с анализом раствора экстракта биопробы, проводят анализ контрольного раствора идентифицированного вещества. концентрация контрольного раствора (Ck) должна быть близка к концентрации определяемого вещества в растворе экстракта. Анализы контрольного раствора и экстракта биопробы должны проводитьсяв одном масштабе регистрации. Концентрация определяемого вещества в растворе экстракта (Ci) рассчитывается по формуле
Ci = Ck*hi/Hk, где Ck - концентрация контрольного раствора;
hi- высота сигнала определяемого наркотического вещества в
растворе экстракта биопробы; hk - высота пика вещества контрольного раствора.
Метод внутреннего стандарта
В соответствии с методом внутреннего стандарта в биообьект до операции пробоподготовки добавляется известное количество вещества, принятого за стандарт. Это вещество должно полностью отделяться от других компонентов образца, элюироваться близко к пику анализируемого соединения, не реагировать с другими компонентами, т.е. удовлетворять требованиям, предъявляемым к внутреннему стандарту. Можно использовать одновременно два и более внутренних стандарта. Концентрация определяемогo вещесгва (CI) рассчитывается по формуле
Ci = Cbc * Hi /Hbc *1/Fi/bc, где Свс - концентрация внутреннего стандарта;
hi - высота пика (или площадь) определяемого вещества; hвс - высота пика (или площадь) стандарта; Fi/вc - относительный калибровочный фактор.
Относительный калибровочный фактор компонента Fi/вc вычисляется по формуле
Fi/bc = Hi * Cbc/Ci * Hbc, где hl- высота пика (или площадь) компонента известной концентрации (калибровочный раствор); CI - концентрация калибровочного раствора определяемого компонента; hвс - высота пика (или площадь) внутреннего стандарта;
Сbc - концентрация внутреннего стандарта
Изучив отечественные и зарубежные литературные источники, описывающие различные инструментальные методы анализа группы производных бензодиазепина, а также опираясь на результаты наших исследований мы пришли к выводу, что оптимальной комбинацией в анализе производных бензодиазепина является применение в качестве:
• предварительного метода анализа – метод ПФИА с использованием пороговой концентрации 100 нг/мл,
• подтверждающего метода анализа – метод газовой хроматографиии с масс селективным детектором или газовой хроматографии с электронно-захватным детектором,
• метода количественного определения – высоко-эффективная жидкостная хроматография с диодно-матричным детектором.
Хлордиазепоксид (элениум, хлозепид)
Практически нерастворим в воде, растворим в воде соли 1,4-бенздиазепинов. В органических растворителях растворимость зависит от структуры. Наиболее высокая растворимость наблюдается в апротонных растворителях (диметилформамиде, диметилсульфоксиде). Слабое основание.pKa = 2.93
Выводятся производные 1,4-бенздиазепина, в основном, почками в виде основных соединений и метаболитов. Наличие в органах активных метаболитов производных 1,4-бенздиазепина снижает скорость элиминации. Время полувыведения (Т ½) 8-28 часов.
Хлордиазепоксид относится к транквилизаторам. Он оказывает успокаивающее действие на центральную нервную систему, обладает противосудорожной активностью, потенцирует действие снотворных веществ и анальгетиков, проявляет умеренный снотворный эффект.
Хлордиазепоксид (7-хлор-2-метиламино-5-фенил-ЗН-1,4-бензодиазепин-4-оксид) быстро всасывается из желудочно-кишечного тракта. Метаболитами хлордиазепоксида является N-деметилхлордиазепоксид и лактам (7-хлор-1,3-дигидро-5-фенил-2Н-1,4-бензодиазепин-2-он-4-оксид). Часть неизмененного хлордиазепоксида и его метаболитов выделяется с мочой, а часть — образует конъюгаты, которые тоже выделяются с мочой.
Пробоподготовка.
· 25 г измельченного биологического материала + вода + HCl до рН = 1 à 3 раза по одному часу à вытяжки центрифугируют à центрифугат подщелачивают до рН = 10 + хлороформ à 3 раза взбалтывают àхлороформные вытяжки соединяют à обнаружение и количественное определение хлордиазепоксида.
· 5 - 10 мл плазмы крови или мочи + аммиак à дважды взбалтывают с хлороформом à хлороформные вытяжки + вода àвзбалтываютà хлороформный слой + 5 мл р-ра соляной кислоты à взбалтывают 5 минà солянокислые вытяжки отделяют à нагревают на водяной банеà затем нагревают при 125 °С на парафиновой бане 30 мин (при этом образуется 2-амино-5-хлорбензофенон)à + 0,5 мл 10 %-го р-ра нитрита натрия + 0,5 мл 0,5 %-го раствора сульфамината аммония + 0,5 мл 0,1 %-го раствора N-1-нафтилэтилендиамина дигидрохлоридаà вишнево-красная окраска.
Цветные реакции.
1. Реакция с нингидрином, хлордиазепоксид дает коричневую окраску.
2. Реакция с реактивом Марки, хлордиазепоксид дает желтую окраску.
3. Реакция с реактивом Фреде, хлордиазепоксид дает оранжевую окраску.
4. Реакция Витали — Морена, хлордиазепоксид дает желтую окраску.
ТСХ-обнаружение
Обнаружение хлордиазепоксида методом хроматографии в тонком слое сорбента.
НФ: силикагель КСК или пластинки «силуфол»
ПФ: этилацетат : 25 %-го р-р аммиака : метиловый спирт
хлороформ : ацетон
Д: р-в Драгендорфа
Использование спектров.
5. Обнаружение хлордиазепоксида по УФ- и ИК-спектрам. Хлордиазепоксид в 0,1 н. растворе гидроксида натрия имеет максимумы поглощения при 243 и 260 нм; в 0,1 н. растворе серной кислоты хлордиазепоксид имеет максимумы поглощения при 245 и 306 нм.
6. Хлордиазепоксид в 0,1 н. растворе соляной кислоты имеет максимумы поглощения при 246 и 308 нм.
Диазепам (седуксен)
Диазепам (седуксен, эридан,реланиум и др.) представляет собой белый или белый с желтоватым оттенком кристаллический порошок, не растворяется в воде, трудно растворяется в этиловом спирте, растворяется в хлороформе.
Т1/2 = 20-55 часов.
По действию на организм диазепам относится к транквилизаторам. Он способствует нормализации сна, применяется для лечения невротических состояний, уменьшает чувство страха и т. д.
Диазепам быстро всасывается в пищевом канале.
Метаболизм:
· образуются продукты N-деметилирования à оксазепам à глюкуронид
· гидроксилирование диазепама à глюкуронид
Выделение из крови и мочи.
10 мл мочи/5 мл крови + равный объем фосфатного буферного раствора (рН = 7,0)à 2 раза по 5 мин взбалтывают с диэтиловым эфиром à эфирные вытяжки + NaOH à дважды взбалтываютà + вода à эфирная вытяжка + HCl à встряхивание 10 мин à отделение солянокислой вытяжки à ФЭК
Параллельно измеряют оптическую плотность диазепама, обработанного указанным выше способом. Наличие максимумов поглощения при 242 и 287 нм указывает на наличие диазепама в крови или моче.
Качественные реакции.
· Реакция с нингидрином. Р-р диазепама в этиловом спирте + 10 мг нингидрина à водяная баня + 5 мл этилового спирта à синяя окраска + 1 %-го раствора сульфата меди àкрасная.
ТСХ-обнаружение.
НФ: силикагель КСК/силуфол
ПФ: этилацетат : р-р аммиака : метиловый спирт
хлороформ : ацетон
Д: реактив Драгендорфа.
Спектральный анализ.
Диазепам в 2 н. растворе соляной кислоты имеет максимумы поглощения при 242 и 287 нм, в 0,1 н. растворе серной кислоты имеет максимумы поглощения при 241, 284 и 359 нм; в ИК-области спектра диазепам имеет основные пики при 1681, 1484 и 1313 см -1.
Оксазепам
Т1/2 = 5-15 часов.
Он представляет собой кристаллический порошок, почти не растворимый в воде, растворимый в этиловом спирте и хлороформе.
По фармакологическим свойствам оксазепам близкий к хлордиазепоксиду и диазепаму. Он менее токсичен, чем диазепам, обладает слабым противосудорожным действием и миорелаксантным эффектом.
Метаболизм. Оксазепам явдяется одним из метаболитов диазепама. После приема оксазепама максимальный уровень его в плазме достигается через 4 ч, а через 48 ч он исчезает из плазмы. Оксазепам находится в плазме в виде глюкуронида. В виде глюкуронида он выделяется с мочой, а с калом он выделяется в неизмененном виде.