Будова бактеріальної клітини

Мета роботи: Вивчення будови бактеріальної клітини

Теоретичні основи: Не дивлячись на зовнішню простоту організації, будова бак­теріальної клітини досить складна. Цитоплазма бактеріальних клітин оточена трьома оболонками - цитоплазматичною мембраною, клітинною стінкою та капсулою, які виконують життєво важливі функції.

У цитоплазматичному матриксі розташовані нуклеоїд, рибосо­ми, внутрішньоцитоплазматичні мембранні утворення, а також ряд інших внутрішньоклітинних утворень, таких як газові вакуолі, карбоксісоми, магнітосоми, які зустрічаються у окремих представників прокаріотів.

У цитоплазмі бактерій виявляються різні включення, які є продуктами клітинного метаболізму і запасними поживними речо­винами. У клітинах це безазотисті органічні речовини — глікоген, крохмаль, гранулеза; жироподібні речовини - полі-b-оксимасляна кислота та азотовміщуючі запасні речовини - цианофіцинові грану­ли, а також гранули волютину, включення сірки та карбонату кальцію. Багато з цих структур добре видно у світловий мікроскоп при відповідних методах забарвлення.

А) Виявлення капсул

При звичайних методах забарвлення капсули залишаються без­барвними. Для виявлення капсул застосовують спеціальні методи за­барвлення. Метод Буррі-Гінса складається з декількох етапів.

1. Краплю досліджуваної культури Bac. anthracoides вміщують на край скельця та ретельно змішують з краплиною туші.

2. До краплини досліджуваної рідини під кутом 45° підводять край шліфованого скельця, крапля при цьому розтікається по його краю. Швидким рухом шліфовального скельця готують препарат по типу мазка крові.

3. Препарат висушують, фіксують у полум'ї пальника та забарвлюють протягом 2 - 3 хвилин фуксином Циля.

4. Забарвлений мазок промивають водою, підсушують та мікроскопують за допомогою імерсійного об'єктива.

Туш утворює темний фон препарату, на якому добре видно безбарвні капсули, які оточують забарвлені фуксином бактеріальні клітини.

Б) Виявлення спор у бактерій

Виявлення здатності культури до спороутворення краще проводити у старих культурах. Спори у бактерій можна виявити при мікроскопіюванні препарату "роздавлена крапля" у світловому полі. Спори заломлюють світло сильніше, ніж інша частина клітини, і їх видно у клітині як більш темні включення округлої чи овальної фор­ми.

Проте для виявлення спор краще використовувати складні ме­тоди забарвлення клітин. Оболонка спор важко проникна для барвника. Тому всі наявні способи забарвлення спор засновані на тому, що попередньо сильним барвником з прогріванням забарвлюють од­ночасно клітину і спору. Потім протоплазму клітини знебарвлюють, залишаючи спору забарвленою. Додаткове забарвлення цитоплазми найчастіше виконують контрастним до кольору спори барвником. Найбільш розповсюдженим є спосіб Ожешки.

Спосіб Ожешки

1. На знежиреному предметному скельці готують тонкий мазок бак­терій Вас. subtilis, висушують його на повітрі та, не фіксуючи, за­ливають 0,5 % розчином НСl.

2. Мазок підігрівають протягом 2 хвилин у струмені теплого повітря пальника до появи парів.

3. Кислоту зливають, препарат промивають водою, мазок закрива­ють фільтрувальним папером та заливають карболовим фуксином Циля.

4. Препарат забарвлюють протягом 5 хвилин при нагріванні над по­лум'ям пальника до появи парів. По мірі випаровування барвника його періодично додають, не даючи препарату підсохнути.

5. Препарат промивають водою та обробляють протягом 2 хвилин 1 % розчином сірчаної кислоти для знебарвлення.

6. Препарат знову промивають водою та забарвлюють розчином метиленового синього 1 : 40 протягом 10 – 15 хвилин.

7. Барвник зливають та мікроскопіюють з імерсійною системою. При правильному забарвленні клітини повинні бути синіми, а спори червоними.

В)Виявлення деяких включень у клітинах мікроорганізмів

Виявлення жиру та гранул полі-b-оксибутирату

1. На предметне скельце наносять краплину мікробної суспензії Saccharomyces cerevisiae з краплиною розчину судана III та накри­вають покривним скельцем.

2. Мікроскопують з об'єктивом 40х та 90х. У полі зору мікроскопа видно рожево-червоні краплини ліпідів у безбарвній цитоплазмі.

Виявлення гранул волютинy методом Омелянського

Сутність забарвлення заснована на поганій розчинності мета-хроматичних гранул у розчинах кислот.

1. Готують фіксований препарат Saccharomycеs cerevisiae.

2. На мазок наносять фуксин Циля та забарвлюють клітини протягом 30 - 60 секунд.

3. Промивають препарат водою та наносять на мазок 1 % розчин сірчаної кислоти на 20 - 30 секунд. Клітини знебарвлюються, а стійкий до дії кислот волютин зберігає забарвлення.

4. Препарат промивають водою та додатково контрастно забарв­люють метиленовим синім у розведенні 1 : 40 протягом 15 - 30 се­кунд.

5. Барвник змивають водою, препарат просушують фільтрувальним папером та мікроскопують з об'єктивом 90х.

У полі зору мікроскопа гранули волютину забарвлюються в червоний колір, цитоплазма клітини - в синій.

Матеріали, реактиви й устаткування: Предметні та покривні скельця, бактеріологічні петлі, пробірки з стерильною водопровідною водою, сірники, сухе пальне, фільтрувальний папір, кедрова олія, фуксин Циля, розчин судана III, розчин метиленового синього 1:40, розчин туші, 0,5 % розчин НС1, 0,5% розчин нейтрального червоного, 1% розчин H₂S0₄, культури Вас. anthracoidеs. Вас. sublilis, Saccharomyces cerevisiae, Candida tropicales.

Хід роботи:

1. Приготувати препарат з культури Вас. anthracoides для виявлення капсул.

2. Забарвити ендоспори культури Вас. subtilis.

3. Виявити включения жиру в клітинах Sаcchаromyces cerevisiae та гранул полі-b-оксимасляної кислоти у цієї культури.

4. Виявити включения волютину в культурі Sасchаromyces cеrevisiaе.

5. Промікроскопіювати та.

Контрольні питання:

1. Методика забарвлення капсул бактерій

2. Методика забарвлення спор у бактерій

3. Методика виявлення включень в клітинах мікроорганізмів.

Форма звітного бланка до лабораторної роботи № 9.

Група	Курс	Лабораторна робота № 9
		Будова бактеріальної клітини
Прізвище студента
1) Замалювати готові препарати забарвлених по методу Романовського-Гімза ядер Candida tropicales, нуклеоїдів у клітинах Вас. anthracoidеs, джгутиків у культурі Proteus vulgaris 2) Відповідь на контрольні питання 3) Висновки по лабораторній роботі № 9
Роботу прийняв		Дата		Підпис

Лабораторна робота № 10