Специфичность иммуноанализов

Специфичность диагностической тест-системы - параметр, характеризующий ее распознавательные возможности в отношении именно данного заболевания, которое она «не путает» с другими.

Диагностическая эффективность тест-систем

Диагностическая эффективность - это параметр, характеризующий возможности данной тест-системы одновременно правильно определять позитивные пробы как позитивные, а негативные пробы - как негативные.

Положительная и отрицательная предсказательная значимость тестсистем.

Есть еще и такие характеристики диагностических тест-систем, как положительная предсказательная значимость (ППЗ) и отрицательная предсказательная значимость (ОПЗ). Чтобы пользоваться данными характеристиками (и это отличает их от приведенных выше

чувствительности и специфичности), необходимо знание реальной распространенности данного инфекционного заболевания в обследуемых популяциях населения.

ППЗ рассчитывают как частоту встречаемости инфицированных людей среди всех индивидуумов, определенных данной тест-системой как позитивные:

ОПЗ тест-системы рассчитывают как частоту неинфицированных людей среди всех индивидуумов, определенных данной тест-системой как отрицательные:

4.4. ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОЛИЧЕСТВА КЛЕТОК, СЕКРЕТИРУЮЩИХ ТОТ ИЛИ ИНОЙ ПРОДУКТ, - МЕТОД ELISPOT

Метод ELISPOT (Enzyme-linked immunospot, spot - пятно) был разработан в 1983 г. двумя группами авторов (Sedgwick J.D., Holt P.G., Czerkinsky C.C. et al.) для подсчета числа антителообразующих клеток. ELISPOT пришел на смену знаменитому методу локального гемолиза в агаре Н. Йерне.

Идея метода ELISPOT состоит в использовании культуры клеток in vitro при проведении ловушечного твердофазного иммуноанализа на пористой поверхности (рис. 4.12, см. также цв. вклейку). В настоящее время промышленность выпускает планшеты для культивирования (чаще всего 96-луночные, той же стандартной формы, что и планшеты для ИФА), дно которых покрыто нитроцеллюлозной мембраной. На нитроцеллюлозе сорбируют интересующий антиген, после чего в лунки помещают лимфоциты в полноценной культуральной среде и культивируют их в оптимальных для живых клеток условиях (СО₂-инкубатор, оптимальная плотность посадки клеток, все необходимые метаболические добавки и т.д.). Через несколько часов или

Рис. 4.12.Общий принцип метода ELISPOT для определения количества клеток, секретирующих цитокины

1, 2, 3 сут (условия подбирают опытным путем) клетки тщательно вымывают из лунок в проточной системе физраствором или водой с детергентом (например, 0,1% Tween-20 или др.).

Если какие-то клетки секретировали антитела против антигена, сорбированного на дне, то на этом дне фиксируются иммунные комплексы «антиген-антитело». Затем добавляют антииммуноглобулиновый конъюгат с ферментом, инкубируют, промывают, добавляют бесцветный субстрат. Фермент, остающийся после промывок только в точках, в которых лежали во время культивирования антителообразующие клетки (пористая поверхность не позволяет клеткам «кататься» по дну лунок), катализирует образование цветного продукта. В результате на дне лунок образуются окрашенные пятна в тех точках, над которыми лежали антителообразующие клетки (АОК). Первоначально пятна пытались подсчитывать визуально. Получали нечеткие субъективные результаты. Вскоре разработали несложное приборное оборудование, состоящее из миниатюрной видеокамеры, которая фиксирует изображение каждой лунки планшета и в цифровом виде отправляет эту информацию в компьютер. С помощью специально созданного программного обеспечения (самый дорогостоящий компонент метода) стали проводить анализ данных, сравнивая опытные лунки с контрольными и определяя количество искомых клеток на (например) 10⁶ общего числа клеток в исследуемой суспензии.

Вскоре стало очевидно: метод ELISPOT весьма универсален и пригоден для под-

счета, скажем, клеток, продуцирующих тот или иной цитокин. В данном случае первым слоем на дно специальных планшетов для ELISPOT сорбируют моноклональные антитела против интересующего цитокина. Затем помещают в лунки культуру исследуемых клеток. Специфическим и творческим моментом в данном случае является добавление в культуру стимуляторов продукции заданного цитокина. Дальнейшие этапы выполнения метода те же, что при подсчете АОК.

Метод ELISPOT, несмотря на весьма высокие цены на реагенты и приборы, включен в международные протоколы обязательных исследований при разработках и клинических испытаниях вакцин. Мы приведем в качестве примера более подробный протокол методики с применением для повышения чувствительности авидин-биотиновой системы. Методика в целом включает два этапа:

1-й - стерильное культивирование живых и функционирующих

клеток;

2-й - иммуноанализ в тех же планшетах, но уже в нестерильных условиях.

Стерильные условия работы

1. Антицитокиновое антитело-1 сорбируют на пористой твердой фазе культурального планшета (это антитело - ловушка для секретируемого цитокина).

2. В планшет помещают исследуемые клетки (суспензию в различных концентрациях - от 10⁵ до 2х10⁶ в 1 мл).

3. К клеткам добавляют стимулятор в различных концентрациях.

4. Систему культивируют в оптимальных условиях в течение 2-24 ч или больше (подбирают оптимум).

Нестерильные условия работы

1. Лунки тщательно промывают сначала водой с целью удаления клеток, затем отмывочным буфером с детергентом (0,1% Tween-20), чтобы смыть все, что плохо связалось.

2. В лунки вносят конъюгат проявляющего антитела-2 с биотином, инкубируют 2 ч.

3. Промывают и вносят конъюгат «авидин-пероксидаза», инкубируют 1 ч.

4. Промывают и вносят субстратную смесь - АЕС [3-амино-9- этилкарбазол, растворенный исходно в N,N-диметилформамиде (100 мг АЕС на 10 мл DMF) и разбавленный до конечной концентрации в 0,1 М ацетатном буфере, рН 5 и плюс перекись водорода; рецепт

субстратной смеси: 333,3 мкл матричного раствора АЕС + 10 мл ацетатного буфера + 5 мкл 30% перекиси водорода].

5. Реакцию останавливают под визуальным контролем через 5-50 мин путем промывки плэйтов водой.

6. Плэйты сушат при комнатной температуре в темноте в течение 2 ч.

7. Регистрируют результат, т.е. подсчитывают пятна: либо «вручную», под соответствующим микроскопом (результаты получают в «двоичной системе» - «много» или «мало»), либо в специальном аппарате, считывающем картину дна лунок видеокамерой и соответствующей компьютерной программой анализа пятен (получают цифровой результат).

Результаты, получаемые в ELISPOT, отражены на рис. 4.13 (см. также цв. вклейку).

Рис. 4.13.Примеры результатов ELISPOT: увеличенное изображение двух лунок: лунки с положительным результатом (а), с четко различимыми «пятнами», подлежащими подсчету; лунки с отрицательным результатом (б)