Система сбора и обработки данных

Сигналы, поступающие от детекторов, усиливаются, их амплитуды измеряются и анализируются в цифровой форме для каждой клетки отдельно. Ограничения, накладываемые на регистрируемый параметр, называются окнами («gate»). Окна выделяются автоматически или вручную (рис. 2.5, см. также цв. вклейку). Результаты анализа используются для построения распределений исследованных клеток по их характеристикам. Эти распределения называют гистограммами.

Рис. 2.5.Выделение окон лимфоцитов, моноцитов, нейтрофилов по светорассеянию

Применение метода проточной цитометрии

Рис. 2.6.Проточный цитофлуориметр

Современные проточные цитометры обладают высокой чувствительностью, высоким уровнем автоматизации, просты в эксплуатации, имеют небольшие размеры (рис. 2.6, см. также цв. вклейку). Проточная цитометрия стала незаменимым методом диагностики различных иммунопатологических состояний в клинической практике: успешно используется в гематологических лабораториях, для оценки иммунного статуса, в онкологии. Метод позволяет:

• проводить иммунофенотипирование клеток: дифференцировать популяции лейкоцитов, определять субпопуляционный состав лимфоцитов;

• оценивать функциональную активность клеток;

• проводить анализ клеточного цикла и плоидности клеток;

• проводить анализ программируемой клеточной гибели (апоптоза);

• определять внутриклеточные и растворимые формы цитокинов;

• оценивать фагоцитарную активность клеток;

• проводить анализ биологических жидкостей (секреты, слюна и др.);

• проводить количественное и качественное исследование pH, концентрации свободных ионов кальция, уровня окислительных процессов;

• осуществлять мониторинг иммунодефицитных состояний, проводить онкогематологические исследования.

Количественное определение субпопуляций лимфоцитов с помощью проточной лазерной цитометрии с использованием моноклональных антител

Фенотипирование лимфоцитов широко применяется в клинической иммунологии. В основе метода лежит взаимодействие моноклональных антител, меченных флуоресцентной меткой, с поверхностными антигенами лимфоцитов и последующий анализ образцов на проточном цитометре. Возможно использование одного моноклонального антитела, меченного флуорохромом, или двух различающихся по специфичности моноклональных антител, меченных разными флуорохромами (рис. 2.7). Определяют процент клеток, несущих на своей поверхности искомый антиген, и среднюю интенсивность свечения, которая характеризует выраженность экспрессии исследуемого антигена. Для проведения исследования можно использовать как цельную кровь, так и предварительно выделенные

из периферической крови обследуемого лейкоциты или мононуклеарные клетки. Разработаны многоцветовые цитометры.

Рис. 2.7.Дот-анализ: двойное окрашивание по CD3 и CD4

Лабораторная работа 2-3

1. Получают гепаринизированную периферическую венозную кровь (20-25 ЕД гепарина на 1 мл крови) в объеме 5 мл.

2. Лейкоциты выделяют из периферической крови. Для этого добавляют в пробирку 0,3% раствор желатины, перемешивают и инкубируют в термостате 30 мин при 37 °С для осаждения эритроцитов. Собирают лейкомассу. Клетки отмывают полной культуральной средой, центрифугируя при 1000 об/мин в течение 10 мин. Процедуру отмывки проводят дважды.

3. К клеточному осадку добавляют 50 мкл полной культуральной среды. Затем в каждую пробирку вносят по 50 мкл предварительно разведенного образца нужных моноклональных антител (монАТ), меченных флуорохромами. Одна пробирка (контроль) содержит только клетки и полную культуральную среду.В остальные пробирки добавляют монАТ - CD3, CD4, CD8, CD19 и другие в зависимости от цели эксперимента.

4. Пробирки инкубируют 30 мин при 4 °С.

5. Клетки отмывают от излишних монАТ в полной культуральной среде центрифугированием при 1000 об/мин в течение 5 мин.

6. Оставшиеся в пробе эритроциты лизируют, добавляя к клеточному осадку лизирующий раствор, состоящий из 0,8% раствора NH₄Cl, 0,1% раствора NaHCO₃, 0,0037% натриевой соли ЭДТА (рН = 7,2-7,4).

7. Проводят встряхивание проб на шейкере 1 мин.

8. Образцы центрифугируют 5 мин при 1000 об/мин. Надосадочную жидкость сливают, добавляют полную культуральную среду и повторяют центрифугирование в том же режиме.

9. Для фиксации меченых клеток в каждую пробу добавляют по 100 мкл 2% параформальдегида и инкубируют 30 мин при 4 °С.

10. Анализ образцов проводят на проточном цитометре. Содержание основных субпопуляций лимфоцитов в периферической крови здоровых людей представлено в табл. 2.2.