Окраска риккетсий по методу Здродовского

1. Окрасить мазок разведенным фуксином Циля (10—15 ка­пель на 10 мл дистиллированной воды) в течение 5 мин.

2. Промыть водой.

3. Обработать мазок 0,5 % раствором лимонной кислоты или 0,01 % раствором хлористоводородной кислоты.

4. Промыть водой.

5. Окрасить метиленовым синим в течение 1 мин.

6. Промыть водой и высушить препарат.

Риккетсий, окрашенные по методу Здродовского, имеют красный цвет, цитоплазма клеток, в которых они паразитиру­ют, — голубая, ядра — синие.

Глава 3

ФИЗИОЛОГИЯ БАКТЕРИЙ

Введение.Бактерии в ходе эволюции освоили различные экологические ниши и приспособились к соответствующим источникам неорганических и органических веществ, наличию кислорода, температуре и другим факторам окружающей сре­ды. Создание условий, подходящих для выращивания (культи­вирования) микробов, необходимо для изучения их свойств и диагностики вызываемых ими заболеваний. Культивирование бактерий лежит в основе бактериологических методов иссле­дования.

Питательные среды.Применяют для выращивания (культи­вирования) микроорганизмов в лабораторных или промышлен­ных условиях. Любая питательная среда должна отвечать сле­дующим требованиям:

—содержать все необходимые для роста и размножения бактерий вещества в легкоусвояемой форме;

—иметь оптимальные для бактерий физико-химические свойства: рН, влажность, осмолярность и др.

Компоненты питательных сред.Для построения органичес­ких компонентов микробной клетки необходимы азот, углерод, водород и кислород. Снабжение водородом и кислородом осу­ществляется за счет воды. В качестве источника углерода гете­ротрофные микроорганизмы используют органические соеди­нения, в первую очередь сахара, многоатомные спирты и ор­ганические кислоты. Источником азота могут служить неор­ганические соединения (соли аммония), а также олигопептиды и аминокислоты — продукты гидролиза белков различного про­исхождения (животного — мясо, рыба, казеин; растительного — соевые бобы, горох; микробного — дрожжи и др.).

Поскольку в состав микробных клеток входят не только органические, но и минеральные соединения, питательные среды должны содержать неорганические вещества: соедине­ния хлора, фосфора, серы, натрия, калия, кальция, магния и некоторые другие. Минеральные соли необходимы также для создания оптимальных для роста и размножения физико-хи­мических условий (рН, ионная сила и т.д.).

Микробам для нормального развития необходимы микро­элементы, преимущественно металлы (железо, медь, марганец и др.), которые входят в состав простетических групп молекул различных ферментов.

Кроме основных компонентов питательной среды, для жиз­недеятельности ауксотрофных микроорганизмов, к числу ко­торых относятся многие патогенные бактерии, требуется при­сутствие факторов роста — органических соединений, входя­щих в состав микробной клетки, но не синтезируемых ею самостоятельно. В качестве факторов роста могут выступать определенные аминокислоты, азотистые основания, витамины и др. Большинство бактерий нуждается в таких факторах роста, как витамины группы В и никотиновая кислота. Для роста некоторых патогенных бактерий в питательные среды надо добавлять нативные белки (кровь, сыворотку).

Для жизнедеятельности микробной клетки, безусловно, не­обходима вода как основной растворитель и среда для проте­кания всех биохимических реакций.

В бактериологической практике используют среды, различ­ные по происхождению. Синтетическими питательными сре­дами называют такие, которые состоят из растворов химически чистых соединений в точно установленных дозировках. Пре­имуществом синтетических сред являются их строго постоян­ный состав и воспроизводимость. Полусинтетические среды включают наряду с химически чистыми соединениями перера-

ботанные нативные компоненты неопределенного состава — гидролизаты мяса, дрожжевой экстракт и т.д. Натуральные питательные среды представляют собой неизмененные натив­ные (природные) компоненты (сыворотка крови, яичный белок и др.).

Различные потребности микробов отдельных видов обуслов­ливают большое разнообразие питательных сред.

По консистенции питательные среды могут быть жидкими, полужидкими, плотными. Для придания плотной консистен­ции к жидкой среде добавляют агар-агар, представляющий собой продукт переработки особого вида морских водорослей. Агар-агар плавится при 80—86 "С, затвердевает при темпера­туре около 40 "С и в застывшем состоянии придает среде плот­ность. В плотные среды добавляют 1,5—2 %, в полужидкие — 0,3—0,7 % агар-агара. В некоторых случаях для получения плотных питательных сред используют нативные компоненты (свернувшаяся сыворотка крови, свернувшийся яичный белок), которые сами по себе являются плотными.

Преимуществом плотных питательных сред является воз­можность получения чистых культур микроорганизмов, а также сообществ микроорганизмов (колоний, бактериальных газо­нов), имеющих макроскопические размеры.

По целевому назначению питательные среды делят на основ­ные, элективные и дифференциально-диагностические.

К основным относятся среды, применяемые для выращива­ния многих бактерий. Это триптические гидролизаты мясных, рыбных продуктов, крови животных или казеина, из которых готовят жидкую среду — питательный бульон и плотную — пи­тательный агар. Такие среды также служат основой для приго­товления сложных питательных сред — сахарных, кровяных и др., удовлетворяющих пищевые потребности патогенных бак­терий.

Элективные питательные среды предназначены для избира­тельного выделения и накопления микроорганизмов опреде­ленного вида (или определенной группы) из материалов, со­держащих разнообразную постороннюю микрофлору. При со­здании элективных питательных сред исходят из биологичес­ких особенностей, которые отличают данные микробы от боль­шинства других. Например, избирательный рост стафилокок­ков наблюдается при повышенной концентрации хлорида на­трия, холерного вибриона — в щелочной среде и т.д.

Дифференциально-диагностические питательные среды при­меняют для различения (дифференциации) отдельных видов (или групп) микробов. Принцип составления этих сред осно­ван на различиях в биохимической активности бактерий раз­ных видов вследствие неодинакового набора ферментов.

В состав дифференциально-диагностической среды входят следующие компоненты: а) основная питательная среда, обес-

печивающая размножение бактерий, б) определенный углевод (например, лактоза), способность использовать который явля­ется диагностическим признаком для данного вида, в) цвет­ной индикатор (например, индикатор Андреде), изменение цвета которого свидетельствует о сдвиге рН среды в кислую сторону вследствие ферментации соответствующего углевода. Дифференциально-диагностические среды широко использу­ют в лабораторных микробиологических диагностических исследованиях для дифференциации и идентификации бак­терий.

Культивирование бактерий применяют, в частности, для выделения и идентификации чистых культур (схема 3.1).