Практичне заняття 14
ЛАБОРАТОРНА ДІАГНОСТИКА ХВОРОБ, СПРИЧИНЕНИХ РИКЕТСІЯМИ, ХЛАМІДІЯМИ, МІКОПЛАЗМАМИ
Мета заняття:
— знати особливості взяття патологічного матеріалу на дослідження та його транспортування до бактеріологічної лабораторії, оформлення супровідної документації;
— знати методи мікробіологічної діагностики. Оснащення: таблиці, заздалегідь поставлена PAP.
План
1. Вивчення методів мікробіологічної діагностики висипного тифу.
2. Ознайомлення з методикою проведення PAP для діагностики висипного тифу.
3. Вивчення методів мікробіологічної діагностики хламіді-озів.
4. Вивчення методів мікробіологічної діагностики міко-плазмозів.
Хід заняття
1. Вивчення методів мікробіологічної діагностики висипного тифу
Завдання 1. Вивчіть методи мікробіологічної діагностики епідемічного висипного тифу.
Діагностику епідемічного висипного тифу і хвороби Брилля проводять з урахуванням комплексу клініко-епідеміологічних даних, результатів серологічного дослідження крові хворого з антигеном рикетсій Провачека, а також даних анамнезу про перенесення в минулому епідемічного висипного тифу.
У діагностиці епідемічного висипного тифу та хвороби Брилля вирішальними є серологічні дослідження. Антитіла накопичуються наприкінці 1-го — на початку 2-го тижня захворювання. Основними серологічними реакціями є: реакція аглютинації рикетсій — PAP, РЗК, РИГА, реакція непрямої імунофлюоресценції — РНІФ.
у PAP. Антитіла до рикетсій Провачека виявляють з 5—7-го дня хвороби. З 2-го тижня їх виявляють у всіх хворих у високих титрах (1:160 — 1:640). У період реконвалесценції титр аглютинуючих антитіл зменшується. Анамнестична реакція аглютинації через 1 рік і більше зберігається у низьких титрах (1:10 — 1:20). Діагностичним титром PAP при одноразовій постановці вважають 1:40 у разі використання антигену з рикетсій, накопичуваних за методом Вейгля (у кишках вошей), та 1:160 — у разі використання антигену із рикетсій, накопичуваних у курячих ембріонах.
РЗК — суворо специфічна і високочутлива. Антитіла визначаються з 5—7-ї доби у 48 % хворих, на 2-му тижні — у 96 %, а на 3-му тижні — у 100 %. РЗК зберігається позитивною протягом багатьох років, навіть десятиліть після перенесеної інфекції. Реакцію використовують для ретроспективних досліджень під час пошуків джерел інфекції, а також для виявлення імунологічної структури населення відносно висипного тифу. У разі виявлення активної форми інфекції діагностичний титр РЗК становить 1:160, у разі ретроспективної діагностики — 1:10.
РНГА, на відміну від РЗК, позитивна тільки протягом активної фази висипнотифозної інфекції і в найближчі строки реконвалесценції (до 6 міс).
За допомогою РНГА визначають свіжі або порівняно недавні форми захворювання. Реакція вважається специфічною у розведенні 1:100, надійний діагностичний титр становить 1:1000. У хворих на висипний тиф гемаглютиніни визначаються переважно у високих титрах — 1:1000 — 1:25 000 і вище.
РНІФ — високочутлива і високоспецифічна. На 5—7-у добу хвороби антитіла визначаються у високих титрах: 1:320 — 1:1230, на 10—15-у добу титр антитіл збільшується до 1:2560 — 1:10 240. РНІФ у низьких титрах зберігається багато років і навіть десятиліть, тому її застосовують для визначення гострої форми інфекції, ретроспективної діагностики і виявлення імунологічної структури населення, а також для визначення класів імуноглобулінів під час проведення диференціальної діагностики епідемічної форми хвороби і хвороби Брилля. Для хвороби Брилля як рецидивної форми хвороби характерно накопичення IgG із самого початку хвороби. Для епідемічної форми хвороби характерно, що спочатку накопичуються IgM. Але ці дослідження характерні тільки до 19-го дня хвороби, тому що у більш пізні строки IgG накопичуються як при хворобі Брилля, так і при епідемічній формі хвороби.
Ці серологічні реакції бувають позитивними і при атипових формах висипного тифу, коли клінічно діагностувати висипний тиф неможливо. У динаміці титри антитіл підвищуються до максимуму наприкінці 2-го тижня (14—15 днів), тому дослідження сироватки крові проводять на 6—7-у добу хвороби і повторно через 3—5 діб. У деяких хворих спостерігається "випадання" окремих серологічних реакцій, тому дослідження слід проводити паралельно в двох серологічних реакціях одночасно: PAP і РЗК або PAP і РИГА.
У разі застосування антибіотиків широкого спектра дії (тетрацикліну, рифампіцину) в ранні строки хвороби може спостерігатися зниження титрів антитіл або запізнення їх появи.
Завдання 2. Ознайомтеся з методами мікробіологічної діагностики ендемічного висипного тифу.
Для діагностики ендемічного висипного тифу використовують серологічний і біологічний методи. Для серологічної діагностики використовують PAP і РЗК. їх ставлять так само, як і відповідні реакції при епідемічному висипному тифі, але використовують діагностикум, виготовлений із R. typhi. Ці реакції дають змогу діагностувати ендемічний висипний тиф і провести диференціацію ендемічного й епідемічного висипного тифу.
Біологічний метод здебільшого використовують для диференціації епідемічного й ендемічного висипного тифу. Кров'ю хворого заражають самців морської свинки внутрішньооче-ревинно. Рикетсії Провачека спричинюють у них гарачку, а R. typhi — скротальний феномен (рикетсійний періорхіт).
2. Ознайомлення з методикою проведення PAP для діагностики висипного тифу
Завдання 3. Ознайомтеся з методикою проведення PAP для діагностики висипного тифу.
Реакція аглютинації з рикетсійним антигеном ставиться аналогічно до інших розгорнутих реакцій аглютинації.
Облік результату реакції проводять без збовтування пробірок за системою чотирьох плюсів (від ++++ до -).
3. Вивчення методів мікробіологічної діагностики хламідіозів
Завдання 4. Ознайомтеся з методами мікробіологічної діагностики хламідіозів.
Оптимальними ділянками для розмноження хламідій є циліндрічний епітелій сечостатевих органів: у чоловіків — передній відділ сечівника на глибині 2,5—4 см, у жінок — сечівник і слизова оболонка каналу шийки матки на глибині 1,5 см. Зскрібки зі слизових оболонок сечостатевого каналу у чоловіків відбирають одноразовим зондом (щіточкою, ложечкою Фолькмана або жолобуватим зондом) обертальним рухом на відстані 2—4 см у ділянці човноподібної ямки. Напередодні допускається провокація (гостра їжа, алкоголь), за 4—5 год до взяття матеріалу пацієнту слід утримуватись від випускання сечі. У жінок матеріал відбирають перед або не раніше ніж через 14 діб після менструації. Зскрібки беруть після вилучення слизової пробки із піхвової частини шийки матки, а також із сечостатевого каналу на глибині 0,5—1,5 см. Інструменти для взяття проб обережно вводять у цервікальний канал, не торкаючись стінки піхви, і легким рухом (не до крові!) відбирають матеріал. Зскрібок із кон'юнктиви (верхньої і нижньої повік) беруть затупленим очним скальпелем після анестезії 0,5 % розчином дикаїну. Зскрібки з носових ходів відбирають зондами або ватним тампоном. Досліджують також матеріали, отримані під час діагностичних пункцій, біопсій, хірургічним шляхом, а також секрети статевих залоз, кров, синовіальну рідину суглобів, змиви з бронхів. Для діагностики використовують мікроскопічний, бактеріологічний, серологічний, алергійний і молекулярно-генетичний методи.
Мікроскопічний метод. Одразу після взяття матеріал обертальними рухами наносять на поверхню ямки чистого знежиреного предметного скла так, щоб усі боки тампона торкалися поверхні скла. Мазок висушують на повітрі протягом 20—30 хв і фіксують холодним (4 °С) абсолютним хімічно чистим ацетоном упродовж 5—10 хв. Мазок фарбують за Романовським— Гімзою. В уражених клітинах виявляють цитоплазматичні включення, що утворюються хламідіями. Це зернисті структури, що містять збудника на різних етапах його розмноження. Включення, що містять ретикулярні тільця, забарвлюються в синьо-фіолетовий колір, елементарні тільця (зрілі) — в рожево-червоний.
Одним із найбільш доказових, але і трудомістких є культу-ральний метод (бактеріологічний). Його проводять тільки в спеціалізованих лабораторіях. Для виділення хламідій використовують культуру клітин НеЬа-229, ВНК-21 у вигляді моно-шару на покрівному склі. Інкубують матеріал за 37 °С протягом 48—72 год. Збудника виявляють під мікроскопом у разі фарбування препарату за Романовським—Гімзою.
Серологічний метод використовують для виявлення антитіл у РНІФ, ІФА, РЗК, РИГА.
Для проведення молекулярно-генетичного дослідження використовують ДНК-зондову гібридизацію та ЛПР.
Розроблені і застосовуються імунохроматографічні експрес-методи. Тривалість аналізу становить 10—ЗО хв, але чутливість і специфічність експрес-аналізів набагато нижча від традиційних.
4. Вивчення методів мікробіологічної діагностики мікоплазмозів
' Завдання 5. Вивчіть методи мікробіологічної діагностики мікоплазмозів.
Для дослідження відбирають мокротиння, змиви з бронхів, кров, спинномозкову рідину, а також матеріал із сечостатевих органів. Використовують бактеріологічний і серологічний методи діагностики. Під час бактеріологічного методу посіви виконують у рідке і на щільне спеціальні для мікоплазм поживні середовища. Посіви інкубують за температури 36,5—37 °С протягом 24—48 год. Результат вважають позитивним, якщо після закінчення терміну інкубації колір середовища змінюється від жовтого до рожевого за відсутності каламуті. На щільному поживному середовищі (це саме рідке середовище + агар) посіви інкубують 5 діб в умовах підвищеного вмісту С02. Колонії розглядають під мікроскопом (об'єктив х40).
Виділену культуру ідентифікують за культуральними, морфологічними та біохімічними властивостями. Для їх типуван-ня використовують реакції пригнічення росту або метаболізму специфічними імунними сироватками.
Для виявлення мікоплазм у спермі використовують реакцію імунофлюоресценції.
Для серологічного методу діагностики використовують ІФА, реакцію агрегат-гемаглютинації (РАГА), РПГА.
Контрольні запитання
1. Які методи мікробіологічного дослідження найбільш достовірні для підтвердження діагнозу "висипний тиф"?
2. Яке значення має використання різних серологічних реакцій для діагностики висипного тифу?
3. Які серологічні реакції можна використати для ретроспективної діагностики і для виявлення імунологічної структури населення відносно висипного тифу?
4. Яку серологічну реакцію можна використати для визначення класів імуноглобулінів?
5. З якою метою визначають окремо ІцМ і І§0?
6. Чому для діагностики висипного тифу слід проводити паралельно щонайменше дві серологічні реакції, а не обмежуватися однією?
7. Які методи використовують для диференціальної діагностики епідемічного й ендемічного висипного тифу?
8. Який матеріал і як відбирають на дослідження при хла-мідіозах?
9. Які методи використовують для діагностики хламідіозів?
10. Який матеріал відбирають і якими методами його дослі-
джують при мікоплазмозах?
Тести
1. Рикетсії зазвичай не розмножуються:
а) у курячому ембріоні;
б) на поживних середовищах;
в) у культурі клітин;
г) в організмі тварин.
2. Епідемічний висипний тиф передається шляхом:
а) трансмісивним;
б) повітряно-краплинним;
в) аліментарним;
г) водним.
3. Запалення легень можуть спричинити:
а) М. pneumoniae;
б) U. urealyticum;
в) М. hominis.
4. Інфекційна форма хламідій:
а) елементарні тільця;
б) ініціальні тільця;
в) проміжні тільця.
5. Хвороба Бриля—Цинссера розвивається після:
а) вторинного зараження до одужання;
б) вторинного зараження після одужання;
в) після одужання без додаткового зараження;
г) у період реконвалесценції.
Ситуаційні задачі
1. Після зараження самця морської свинки кров'ю хворого з підозрою на висипний тиф у тварини розвинувся періорхіт. Який висновок слід зробити і які дослідження провести для уточнення діагнозу?
2. Для діагностики висипного тифу використовують РАР. Під час постановки реакції на 6-й день після захворювання титр сироватки становив 1:80, через 10 діб — 1:640. У скільки разів збільшився титр сироватки? Чи підтвердився діагноз?
Домашнє завдання
Підготуйтесь до практичного заняття 15.
Рекомендації щодо самопідготовки до практичного
заняття 15
1. Ознайомтеся з темою і метою практичного заняття, запишіть у щоденнику тему і план заняття.
2. Вивчіть теоретичний матеріал (див. підручник, с. 359— 407; практикум, с. 164—178).
Практичне заняття 15 ЛАБОРАТОРНА ДІАГНОСТИКА ВІРУСНИХ ІНФЕКЦІЙ
Мета заняття:
— знати методи культивування вірусів;
) — знати особливості взяття патологічного матеріалу для дослідження та його транспортування до вірусологічної лабораторії;
— уміти відбирати патологічний матеріал для дослідження;
— уміти оформляти супровідну документацію;
— знати препарати для специфічного лікування та профілактики вірусних інфекцій.
Оснащення: таблиці, відеофільм (по можливості), екскурсія до вірусологічної лабораторії (по можливості), розчин Хенк-са, розлитий у пробірки по 0,5 см3, стерильні сухі тампони для носа і зіва, стерильні шпателі для зіва, клейка стрічка, бланки направлень, пастикові пакети різного розміру, враховуючи розмір пробірок, вата, термоізолюючий контейнер, пакет для направлень, препарати для специфічної профілактики і лікування вірусних інфекцій.
План
1. Ознайомлення з методами культивування вірусів, їх індикації та ідентифікації.
2. Ознайомлення з методами взяття матеріалу при вірусних інфекціях, упаковкою та умовами його транспортування до лабораторії.
3. Відбір вірусовмісного матеріалу при ГРВІ, підготовка його до транспортування.
4. Вивчення препаратів для специфічної профілактики і лікування вірусних інфекцій.
Хід заняття
1. Ознайомлення з методами культивування вірусів,
їх індикації та ідентифікації Завдання 1. Ознайомтеся з методами культивування вірусів, їх індикації та ідентифікації.
Культивування вірусів у вірусологічних лабораторіях проводять з метою виділення їх з клінічного матеріалу і подальшої ідентифікації, а також для культивування лабораторних штамів збудника, приготування діагностичних препаратів та отримання вакцин.
Виділення вірусів потребує багато часу (2—4 тиж) і значних матеріальних витрат.
Для культивування вірусів у сучасних вірусологічних лабораторіях використовують культури клітин і курячі ембріони.
Виділення вірусів на культурах клітин. Культури клітин бувають первинно-трипсинізовані (первинні), перещеплювані та диплоїдні.
\] Первинні культури клітин отримують із тканин людини чи тварини. Для цього шматочки тканин або цілі органи вміщують у 0,25 % розчин трипсину за температури 37 °С і перемішують на магнітній мішалці. Трипсин розщеплює міжклітинну тканину, внаслідок чого тканина або орган розпадається на окремі клітини, тому їх ще називають первинно-трипсинізованими. Через кожні 20—ЗО хв завис клітин відділяють у центрифужні пробірки. Після центрифугування трипсин зливають, а до клітин додають поживне середовище, в якому клітини зберігають свою життєздатність. Ці культури клітин можуть розмножуватися in vitro, зазнають близько 10 поділів, а потім гинуть. Для отримання первинних клітин найчастіше використовують нирки ембріона людини (клітини називають НЕЛ), нирки макаки-резус, африканської зеленої мавпи, ембріона свині, фібробласти курячих ембріонів.
0 Перещеплювані культури клітин — це клітини одного типу, що набули здатності до необмеженого росту. їх отримують із пухлин або з нормальних тканин людей чи тварин, що мають змінений каріотип. Практичні лабораторії отримують перещеплювані клітинні лінії від центральних банків клітинних культур науково-дослідних інститутів. Із перещеплюваних клітинних культур найчастіше використовують такі: HeLa (клітини, отримані з тканин карциноми шийки матки), Нер-2 (із карциноми гортані), KB (із карциноми ротової порожнини), RH (з нирок ембріона людини), Vero (з нирок зеленої мавпи), MDCK (з нирок собаки), SIRC (клітини рогівки кролика).
Диплоїдні клітини — це клітини одного типу, які здатні витримувати in vitro близько 100 поділів, зберігаючи при цьому вихідний диплоїдний набір хромосом.
За визначенням Міжнародного комітету з культур клітин, штамом диплоїдних клітин називається морфологічно однорідна популяція клітин, стабілізована в процесі культивування in vitro, яка має обмежений термін життя і характеризується трьома фазами (фаза стабілізації, активного росту і старіння), зберігає у процесі пасивування каріотип, властивий вихідній тканині, вільна від контамінантів (забруднення будь-якими мікроорганізмами) і не має онкогенної активності. їх отримують із ембріона людини. Ці культури надзвичайно вибагливі до умов культивування, тому їх рідко застосовують у практиці вірусологічних лабораторій. їх використовують здебільшого у виробництві вакцин.
Для отримання культур клітин застосовують поживні середовища. Вони бувають ростові та підтримувальні.
Ростові середовища сприяють розмноженню клітин, їх швидкому росту і утворенню добре сформованих моношарів. Для їх виготовлення використовують стандартні середовища Ігла, Ігла MEM, подвійне середовище 199 та ін. Ці середовища містять оптимальний набір амінокислот, солей, вітамінів, необхідних для підтримання життєдіяльності клітин. До них додають 10 % інактивованої стерильної сироватки крові великої рогатої худоби чи ембріональної телячої сироватки.
Підтримувальні середовища використовують для підтримання життєдіяльності клітин в уже сформованому моношарі з метою забезпечення умов для репродукції вірусів. Для цього використовують ті самі стандартні середовища, але без сироватки, або додають її не більше ніж 2 % . Для пригнічення росту бактерій і цвільових грибів у середовища безпосередньо перед їх використанням додають антибіотики: пеніцилін, стрептоміцин (по 100 мкг/см3).
Клітинні культури використовують у вигляді суспензії або моношару на поверхні скла у флаконах, матрацах, пробірках. Для отримання моношару у стерильний посуд вносять певний об'єм (залежно від розміру посуду) суспензії клітин, додають середовище росту і ставлять у термостат за температури 37 °С. Формування моношару відбувається протягом 48 год. Потім середовище росту видаляють, моношар промивають розчином Хенкса (це збалансований сольовий розчин, який використовують для виготовлення поживних середовищ росту і підтриму-вальних середовищ, а також для промивання клітин, тканин і для транспортування вірусовмісного патологічного матеріалу). Потім вносять 0,1 чи 0,2 см3 (залежно від розміру посуду) ніру совмісного матеріалу і витримують у термостаті за температури 37 °С 1—2 год для адсорбції вірусу на клітинах. Після цього досліджуваний матеріал зливають, моношар промивають розчином Хенкса для видалення токсичних компонентів, заливають підтримувальним середовищем і витримують у термостаті за температури 37 °С 7—17 діб до визначення результатів.
Індикацію вірусів у культурі клітин здійснюють на підставі змін, що виникають у процесі їх репродукції. До таких змін належать:
1. Цитопатична дія (ЦПД) — це морфологічні зміни, що виникли після взаємодії вірусу і клітин. Виділяють три основних види змін: утворення синцитіїв і симпластів (гігантських багатоядерних клітин) унаслідок злиття цитоплазми багатьох клітин; круглоклітинну дегенерацію (ущільнення, зморщування, деструкція клітин), що виникає внаслідок втрати міжклітинних зв'язків; розвиток вогнищ клітинної проліферації, які складаються з декількох шарів клітин.
2. Утворення внутрішньоядерних (віруси герпесу, аденовіруси) або цитоплазматичних (віруси сказу, грипу, віспи) включень.
3. Бляшкоутворення — здатність вірусів локально розмножуватися у клітинній культурі, руйнувати сусідні клітини і формувати у моношарі дефекти — вірусні бляшки. Кожна бляшка — це результат розмноження одного ві-ріону, за кількістю бляшок можна визначити інфекційну активність вірусУ.
4. Реакція гемадсорбції — це здатність інфікованих вірусом клітин адсорбувати на своїй поверхні еритроцити (пара-міксовіруси).
5. Кольорова проба — це зміна кольору індикатора середовища під час розмноження культури клітин і збереження його кольору у разі загибелі культури клітин при репродукції в них вірусу.
6. Інтерференція — пригнічення цитопатичної дії одного вірусу під впливом іншого.
Причиною інтерференції є неспроможність вірусу проникати у клітину, заражену іншим видом вірусу.
Виділення вірусів на курячих ембріонах (мал. 9). Перевагою курячих ембріонів є їх доступність для будь-якої вірусологічної лабораторії, порівняна дешевизна і простота в роботі.
Використовують курячі ембріони (КЕ) віком від 5 до 12— 14 діб. Вік ембріонів, спосіб їх зараження та термін отримання максимальної кількості вірусів залежать від біологічних властивостей вірусів і їх тропізму. Перед зараженням курячі яйця витримують у термостаті за температури 37 °С і 60—70 % відносної вологості (у термостат ставлять лотки з водою). Щоб ембріональні оболонки не злипалися, яйця в термостаті повертають кілька разів на добу. Через деякий час, коли розів'ються ембріони, яйця овоскопують для визначення життєздатності ембріонів. Показником їх життєздатності є наявність самостійних рухів, добре виражений судинний малюнок, пульсація судин. Під час овоскопії на шкаралупі роблять позначки (межу повітряного мішка, місце розміщення ембріона — "темне око" ембріона тощо). Існує декілька способів зараження курячого ембріона: у амніотичну й алантоїсну порожнини, у жовтковий міхур, на хоріоналантоїсну оболонку.
Перед зараженням шкаралупу яйця протирають запаленим спиртовим тампоном і 2 % спиртовим розчином йоду. Стерильною голкою для внутрішньом'язових ін'єкцій у шкаралупі роблять прокол і вводять у ембріон 0,1—0,2 см3 досліджуваного матеріалу. Для дослідження одного виду матеріалу зараяшють не менше ніж 4 курячих ембріони. Отвір від голки закривають парафіном або лейкопластиром. Після зараження ембріони інкубують у термостаті, розміщуючи їх тупим кінцем догори. Температура і тривалість інкубації залежить від біологічних властивостей вірусу. Після закінчення інкубації ембріони охолоджують для максимального звуження кровоносних судин: за температури -10...-18 °С протягом 1—2 год або при 4 °С протягом 16—18 год.
Розтин курячого ембріона проводять у стерильних умовах. Охолоджені яйця вміщують на підставку тупим кінцем догори, дезінфікують шкаралупу спиртом і розчином йоду, потім вирізають у ній отвір над повітряним простором вище за позначену його межу. Ідентифікацію вірусу проводять лише за допомогою серологічних реакцій. Для цього використовують реакцію ІФА, PIA, РГГА, PH, РЗК та ін.
2. Ознайомлення з методами взяття матеріалу при вірусних інфекціях,|упаковкою та умовами його транспортування
до лабораторії
Завдання 2. Ознайомтеся з методами взяття матеріалу при вірусних інфекціях.
Важливою умовою успішного виділення вірусу є правильний відбір патологічного матеріалу і транспортування його до лабораторії. Відбирати матеріал слід у найбільш ранні строки після початку захворювання (при грипі — у перші 2 доби; в осіб, які контактували з хворим, — до появи у них симптомів інфекції; секційний матеріал — відразу після констатування факту смерті хворого). Під час відбору проб слід дотримуватися правил асептики та техніки безпеки.
Під час проведення маніпуляцій, які супроводжуються порушенням цілості шкіри та слизових оболонок, лабораторних досліджень, оброблення інструментарію і білизни, прибирання, розтину трупів тощо медичні працівники і технічний персонал користуються засобами індивідуального захисту (хірургічними халатами, гумовими рукавичками, масками, а в разі потреби — захисним екраном, непромокальними фартухами, нарукавниками, окулярами). Ці дії дають змогу уникнути контакту шкіри та слизових оболонок працівника з кров'ю, тканинами, біологічними рідинами пацієнта.
Матеріал відбирають у стерильний посуд. Для цього використовують пробірки з кришками, що загвинчуються. Для запобігання забрудненню матеріалу бактеріальною мікрофлорою його відбирають в умовах, що максимально наближені до стерильних. Щоб запобігти підсиханню матеріалу й інактивації збудника, проби рекомендують вміщувати у транспортувальне середовище для вірусів (ВТС). До складу ВТС входять: розчин Хенкса (рН 7,4), захисний стабілізуючий агент — сироватковий альбумін великої рогатої худоби, пеніцилін, стрептоміцин і індикатор — феноловий червоний. Тип проби визначається характером захворювання, тропністю збудника до певних органів і систем та періодом перебігу інфекційного процесу. При ГРВІ відбирають назофарингеальні зразки, що містять циліндричні епітеліальні клітини носа і ротоглотки. Назофарингеальні зразки можна взяти одним із трьох способів: полосканням, аспірацією або за допомогою тампона. Під час полоскання хворому рекомендують старанно прополоскати горло 15—20 см3 розчину Хенкса або середовища 199, Ігла протягом 1 хв і зібрати змив у стерильний флакон. Для полоскання можна використати стерильний забуферений ізотонічний розчин натрію хлориду, а потім внести його у ВТС.
Під час аспірації шприцом через надітий на нього тонкий гумовий зонд у ніс вводять декілька сантиметрів кубічних стерильного ізотонічного розчину натрію хлориду, потім цю рідину відсмоктують, вміщують у центрифужну пробірку з ВТС і загвинчують кришку пробірки.
Найчастіше матеріал відбирають за допомогою тампона. Для цього треба мати для одного хворого 2 стерильних сухих ватних (або марлевих) тампони окремо для носа та для ротоглотки. Перед взяттям матеріалу проводять маркірування пробірок з транспортувальним середовищем для вірусів. Спочатку ніс звільняють від слизу. Потім сухий стерильний тампон вводять у порожнину носа хворого по зовнішній стінці, злегка опускають донизу, вводять у нижній носовий хід на глибину 2—3 см, натискають тампоном на зовнішню стінку носа і обертовим рухом знімають десквамований епітелій (епітелій, що злущується з поверхні тканини). Потім тампон опускають у пробірку з 2 см3 середовища ВТС або фосфатного буферного розчину. Другим стерильним тампоном протирають слизову оболонку задньої стінки глотки (докладаючи зусиль, щоб зняти частину епітеліальних клітин). Тампон вміщують у ту саму пробірку з ВТС, закривають пробкою і маркірують. Пробірку з матеріалом охолоджують у холодильнику до 4 °С і доставляють до лабораторії в термосі з льодом, не допускаючи заморожування (при грипі — не пізніше 4 год). У лабораторії ВТС центрифугують 20 хв при 2—3 тис. об/хв і за температури 4 °С. Надосадову рідину використовують для зараження курячих ембріонів і культур клітин, а осад — для проведення імунофлюоресцентної мікроскопії.
Інший патологічний матеріал відбирають переважно за загальноприйнятими методиками, але є деякі особливості.
Спинномозкову рідину відбирають у кількості 1—2 см3, домішки еритроцитів і інших клітинний елементів видаляють центрифугуванням, віруси виділяють з надосадової рідини.
Проби калу відбирають у стерильні флакони з-під пеніциліну, масою 8—10 г (розміром з кісточку сливи). Флакони щільно закривають гумовими пробками. Отримані фекалії розводять розчином Хенкса у співвідношенні 1:10. Для отримання рівномірної суспензії флакон загортають у серветку, яка змочена 70 % розчином етилового спирту, струшують протягом 3—5 хв і центрифугують. Для виділення вірусу відбирають надосадову рідину. Якщо матеріал відбирають ректальним тампоном, його попередньо змочують у ВТС, вводять у пряму кишку обертальним рухом. Після взяття матеріалу тампон вміщують у пробірку з ВТС, відмивають, віджимають і занурюють у дезінфекційний розчин. Отриману завись у пробірці обробляють так само, як суспензію калу.
Кров на вірусологічне дослідження беруть із вени в об'ємі 5—10 см3, краще під час гарячки. Для запобігання згортанню кров дефібринують (струшують зі скляними паличками або додають 1 МО гепарину на 1 см3 крові). Нерозведену кров не замо-роясують і антибіотики не додають.
Кров на серологічне дослідження беруть у об'ємі 3—5 см3. Для отримання парних сироваток кров беруть з інтервалом 12—14 діб: першу пробу на початку захворювання, другу — через 2 тиж. Для отримання сироватки кров поміщають у термостат за 37 °С, утворений згусток відділяють від стінок пробірки скляною паличкою або пастерівською піпеткою. Для збільшення виходу сироватки пробірки із кров'ю, що згорнулася, ставлять у холодильник за температури 4 °С на 18—24 год. Для видалення решти домішок кров центрифугують, потім сироватку переносять у стерильну пробірку і зберігають у замороженому стані до отримання другої проби. Дві проби сироватки досліджують одночасно.
Сеча. Збирають середню порцію сечі в об'ємі 10 см3, охолоджують до 4 °С, центрифугують, надосадову рідину виливають у дезінфекційний розчин, а осад вміщують в 1 см3 ВТС. Осад у ВТС зберігають за 4 °С протягом не більше ніж 48 год перед доставкою до лабораторії. В іншому випадку його заморожують у ВТС за —70 °С і відправляють у пакетах із сухим льодом.
Рідину із серозних оболонок беруть в об'ємі 2 см3. Для виділення вірусів її використовують відразу (додаткового оброблення не потребує) або зберігають замороженою.
Мазок із кон'юнктиви беруть сухим стерильним тампоном і вміщують у ВТС. Після центрифугування використовують відразу або зберігають замороженим.
Вміст везикул. Поверхню шкіри обробляють ефіром або ацетоном. Вміст везикул відсмоктують шприцом із тонкою голкою і переносять у ВТС. Іноді везикули розтинають і вміст відбирають стерильним ватним тампоном, який вміщують у ВТС.
Секційний матеріал відбирають у найбільш ранній термін після смерті хворого. Щоб уникнути контамінації матеріалу бактеріальною мікрофлорою, матеріал відбирають у певній послідовності. Спочатку беруть проби позапорожнинних тканин (лімфатичні вузли, мозок), потім тканини грудної порожнини (до початку розтину черевної порожнини) і в останню чергу — з черевної порожнини. Шматочки тканин масою 1—3 г поміщають у окремі стерильні флакони. Отримані шматочки тканин розтирають у стерильній ступці з додаванням стерильного піску, додають розчин Хенкса у співвідношенні 1:10, центрифугують. До освітленої рідини додають антибіотики і використовують для виділення вірусів негайно або зберігають за температури 20 °С.
На санітарно-вірусологічне дослідження відбирають матеріал з довкілля: ґрунт, воду, молоко і молочні продукти, овочі, фрукти, а також тварин, в організмі яких можуть перебувати віруси (кліщі, молюски, риба тощо). Здійснення вірусологічного нагляду за об'єктами навколишнього середовища потрібне для визначення інтенсивності циркуляції вірусів на певній території, їх типового складу, оцінки ефективності роботи щодо оздоровлення навколишнього середовища.
Завдання 3. Ознайомтеся з упаковкою та умовами транспортування вірусовмісного матеріалу до лабораторії.
Для транспортування до вірусологічної лабораторії вірусовмісний матеріал упаковують у пробірки, які щільно закривають кришками, що закручуються. Крім того, верх пробірки разом із кришкою заклеюють водонепроникною клейкою стрічкою або лейкопластирем. Цю пробірку потім поміщають у пластиковий пакет разом із невеликою кількістю адсорбівного матеріалу (наприклад, ватою). Пластиковий пакет закривають на "замок" або заклеюють чи запаюють.
Всі матеріали мають бути двічі упаковані, тому підготовлені пакети поміщають у пластикові пакети більшого розміру. Якщо від одного пацієнта відбирають декілька зразків, їх пакують окремо у пакети меншого розміру, а потім всі зразки можна помістити в пакет більшого розміру. Зразки, отримані від різних пацієнтів, пакують окремо в різні пакети більшого розміру. Зразки, що упаковані у 2 пластикових пакети, поміщають у пластиковий транспортний контейнер і закривають кришкою, що закручується. Верхню частину контейнера і кришку заклеюють лейкопластиром. Двічі упаковані зразки від одного чи різних пацієнтів транспортують в одному пластиковому контейнері. У цей контейнер також поміщають адсорбівний матеріал. Направлення приклеюють до зовнішньої стінки контейнера (мал. 10).
Щільно закриті, із заклеєними кришками контейнери поміщають у термоізолюючий контейнер, який пристосований для транспортування біологічних матеріалів (мал. 11).
Упаковка зразків має повністю відповідати спеціальній інструкції міжнародного агентства ІАТА № 650 з упаковки і транспортування небезпечних вантажів.
У термоізолюючому контейнері мають знаходитися заморожені холодильні елементи або інші пластикові пакети з льодом
![]() |
(але не з сухим льодом!). Його також заклеюють широкою клейкою стрічкою. На термоізолюючому контейнері вказують ім'я та адресу відправника, ім'я та адресу отримувача, а також інші необхідні та застерігальні надписи.
3. Проведення взяття вірусовмісного матеріалу при ГРВІ, підготовка його до транспортування
Завдання 4. Проведіть взяття вірусовмісного матеріалу при ГРВІ, підготуйте його до транспортування.
Алгоритм "Взяття назофарингеальних зразків при гострій респіраторній вірусній інфекції":
— поставте у штатив 1 пробірку з розчином Хенкса і 2 пробірки із сухими стерильними тампонами;
-— підпишіть на пробірках (з розчином Хенкса) номер аналізу, на тампонах — номер аналізу та місце взяття матеріалу: "Н" (ніс) чи "З" (зів);
— запропонуйте хворому звільнити ніс від слизу;
<с------------------- в*-------------- ч \
Ім'я та адреса відправника
Ім'я та адреса отримувача
\
Зразки для діагностики
Упаковано у відповідності з інструкцією ІАТА № 650
Мал. 11. Зовнішній термоізолюючий контейнер
— уведіть тампон у порожнину носа хворого на глибину 2—3 см і, натискаючи із зусиллям на зовнішню стінку носа, обертовим рухом зніміть десквамований епітелій;
— уведіть цей тампон в інший носовий хід і візьміть матеріал таким самим способом;
— опустіть тампон у розчин Хенкса, ретельно його відмийте і відіжміть об стінки пробірки; закрийте її пробкою;
— тампон помістіть у пробірку, на якій зазначено "Н";
— запропонуйте хворому широко відкрити рота;
— натисніть стерильним шпателем на корінь язика;
— візьміть другим тампоном матеріал із задньої стінки глотки;
— опустіть тампон у ту саму пробірку з розчином Хенкса, відмийте його і відіжміть об стінки цієї пробірки; тампон опустіть у пробірку, на якій зазначено "З"; закрийте її пробкою;
— заклейте пробку і верхню частину пробірки із середовищем Хенкса клейкою стрічкою;
— заповніть направлення.
Алгоритм "Підготовка матеріалу для транспортування до лабораторії":
— помістіть пробірку разом із шматочком вати у пластико-вий пакет меншого розміру;
— помістіть зразок від одного обстежуваного у пластиковий пакет більшого розміру;
— помістіть пакети у термоізолюючий контейнер, обкладіть їх ватою;
— закрийте щільно контейнер, заклейте кришку і верхню частину контейнера клейкою стрічкою;
— покладіть направлення в окремий пластиковий пакет, прикріпіть його до контейнера.
4. Вивчення препаратів для специфічної профілактики і лікування вірусних інфекцій
Завдання 5. Вивчіть препарати, які використовують для специфічної профілактики і лікування вірусних інфекцій.
Розгляньте препарати, визначте принципи використання, а також їх придатність до використання.
Контрольні запитання
1. З якою метою проводять культивування вірусів?
2. Які методи культивування вірусів використовують у сучасних вірусологічних лабораторіях?
3. Що таке первинні (або первинно-трипсинізовані) культури клітин? Як їх отримують?
4. Що таке перещеплювані культури клітин? З чого їх отримують?
5. Що таке диплоїдні клітини? У якому разі їх використовують?
6. Які середовища використовують для вирощування культур клітин і підтримання їх життєдіяльності?
7. Як проводять зараження культури клітин вірусами? За якими ознаками проводять індикацію й ідентифікацію вірусів у культурі клітин?
8. Як проводять виділення вірусів на курячих ембріонах?
9. Яких правил слід дотримуватися під час відбору проб на вірусологічне дослідження?
10. Який патологічний матеріал відбирають для мікробіологічного дослідження при вірусних інфекціях?
11. Якими методами відбирають назофарингєальні зразки?
12. Яке середовище використовують для транспортування вірусовмісного матеріалу?
13. Яким вимогам має відповідати упаковка вірусовмісного матеріалу?
14. У яких умовах транспортують і зберігають вірусовмісний матеріал?
15. Які препарати використовують для специфічної профілактики і лікування вірусних інфекцій?
Тести
1. Метод парних сироваток — це:
а) повторне дослідження сироватки крові хворого, відібра-
ної з інтервалом 1—2 тиж;
б) одночасне дослідження сироватки крові хворого, відібра-
ної з інтервалом 1—2 тиж;
2. Інтерференція вірусів — це:
а) здатність різних вірусів одночасно проникати в еукаріот-
ну клітину;
б) здатність вірусу, що проник у клітину, надавати їй резис-
тентності до проникнення інших вірусів;
в) здатність вірусу, що проник у клітину, полегшувати про-
никнення інших вірусів у цю клітину.
3. Культури клітин, що використовують для репродукції вак-
цинних штамів вірусів:
а) первинно-трипсинізовані;
б) перещеплювані;
в) диплоїд ні.
4. Визначення виду і типу вірусу проводять за:
а) цитопатичною дією;
б) кольоровою пробою;
в) РГА-
г) реакцією нейтралізації.
5. Визначення наявності вірусу в патологічному матеріалі про-
водять за:
а) цитопатичною дією;
б) реакцією ІФА;
в) РГГА;
г) РН.
6. Середовище Ігла використовують для:
а) культивування вірусів;
б) культивування культури клітин.
7. Розчин Хенкса використовують для:
а) культивування вірусів;
б) культивування культури клітин;
в) транспортування вірусовмісного матеріалу.
8. Для транспортування вірусовмісного матеріалу використо-
вують:
а) ВТС;
б) розчин Хенкса;
в) середовище Ігла;
г) всі відповіді правильні.
Ситуаційні задачі
1. Змивом із носоглотки хворого, якому було поставлено діагноз ГРВІ, заразили моношар первинно-трипсинізованих клітин нирок ембріона людини. Через 5 діб інкубації було виявлено цитопатичний ефект. Як визначити родину вірусу?
2. Під час профілактичного обстеження на ВІЛ-інфекцію сироватки крові в реакції ІФА виявився позитивний результат. Чи достатньо цього обстеження для остаточного встановлення діагнозу?
3. При вірусних інфекціях у клітинах людей поряд з ядром клітини (тільця Бабеша—Негрі при сказі) або в ядрі клітини (тільця Коудрі при герпесі) виявляються включення. Що вони собою являють? Як їх виявляють? Де враховують?
Домашнє завдання
Підготуйтесь до практичного заняття 16.
Рекомендації щодо самопідготовки до практичного заняття 16
1. Ознайомтеся з темою і метою практичного заняття, за-
пишіть у щоденнику тему і план заняття.
2. Підготуйтеся до модульного контролю з розділу "Спеці-
альна мікробіологія" (див. підручник, с. 190—435; практикум,
с. 93—180).