Северинов (11.04), первая часть лекции.

Будем говорить про систему CRISPR/Cas, это система иммунности и молекулярной памяти бактерий, основанная не на белках.

История вопроса в том, что очень-очень давно были обнаружены интересные локусы, в конце 80-х годов. Секвенировали Е.Коли и нашли повторы (длина повторов 32-33 нуклеотидов), и разнообразные спейсеры между ними (на картинке прямоугольниками). Расшифровка «CRISP» – короткие регулярно-разделенные палиндромные повторы, входят в эти самые локусы в ДНК. Локус у штамма К12 – 14 повторов и 13 спейсеров. Явно ничего не кодирует, так как рамки считывая здесь нет. Довольно странно, потому что бактерии не любят кодировать повторы. У них есть особая система рекомбинации, которая вымывает повторы. В 90-х годах – активные работы по полногеномному секвенированию прокариот и оказалось, что такого рода локусы очень распространены. В частности, около 50% эубактерий и 100% архей имеют такие локусы. Структура локусов идентична. Последовательности повторов разные у всех организмов, а спейсеры совсем уникальные. Длина таких участков может быть от нескольких повторов до 300-500 повторов. Сам повтор тоже может иметь разную длину у разных организмов – от 20 до 50 нуклеотидов. Спейсеры соответствующей длины, но разные по последовательности.

Используется все это на практике в не очень развитых странах (как наша с вами), так как эти локусы гипервариабельны, у разных кишечных палок и длина локуса, и набор спейсеров разные. На этом можно сделать диагностику - в советском союзе вся эпидемология микобактериальных инфекций делалась на основе этого: отсеквенированы локусы у многих микобактерий. Составлен каталог спейсеров. Спейсеры в виде олигонуклеотидов нанесены на чип. Плюнул в пробирку, узнал набор спейсеров. И уже известно, в какой тюрьме такой набор спейсеров, в Томске или в Омске.

Никакого понимания для чего это нужно не было. Все прояснялось только после появления большего количества последовательностей. Вообще все это очень недавно. Обнаружили, что часто у организма есть несколько локусов (вот у кишечной палочки их два и одинаковые повторы, а бывает, что несколько локусов и разные повторы).

Некоторые локусы КРИСП ассоциированы с генами. Основное свойство этих генов – продукты их не имеют с гомологии ни с чем, что есть в базах данных. Женя Кунин придумал для них название – Ramp (repeat-associated mysterios protein). Потом их назвали Cas (CRISPR-associated genes). В случае Коли таких генов 8 (Cas A, B, C, D, E, 1, 2, 3). Кунин биоинформатически вычленил, что некоторые из этих белков имеют мотивы, которые связывают ионы металлов, а также еще многие из них являются нетипичными ДНК-полимеразами, а также ДНК/РНК-эндонуклеазами. Если последовательность связывается с металлом, то ей явно нужен магний (пара аспартатов близко друг к другу нужна для его связывания). После секвенировании высокой эффективности выяснили: спейсеры ни на что не похожи, их очень много (все микобактериальные спейсеры отличаются от спейсеров кишечной палки и тд). Но при этом не все микобактериальные спейсеры характерны для всех микобастерий). Спейсер – 30-35 нуклеотидов. На что он похож? Секвенировали много вирусов (в том числе вирусов бактерий и архей). Кунин заметил, что определенный процент спейсеров (1-2%) имеет тенденцию быть похожими на участки вирусов, которые на данном организме паразитируют. Процент небольшой, так как мы многих вирусов просто не знаем. Была предположена гипотеза, что это некий модуль иммунности. Некоторый кусок попадает в геном и клетка становится устойчива к этому вирусу. Кунин думал про это в терминах РНК-интерференции, но оказалось она здесь не при чем, но в целом идея верная.

Что же там происходит. Локус транскрибируется – длинная РНК, все складывается из-за повторов, как на картинке. Затем процессинг, который катализируется одним из КРИСП-белков (в данном случае CasE). Этот CasE – специфическая эндорибонуклеаза, кусает под основание шпильки, получается целый набор коротких РНК, длиной около 60 нуклеотидов, имеющих отличные спейсеры и одинаковые повторы. Что-то похожее на антитела (одинаковые белковые молекулы с вариабельным участком).

Система работы называется интерференцией. Желтые – комплекс Cascade. Сложная стехиометрия и молекулярный вес 0,5 млн дальтон (похож по размеру на РНК-полимеразу). По структуре он похож на морского конька. Комплекс этот может связывать индивидуальные КРИСП РНК, при этом спейсер растягивается. Мишенью после связывания с РНК является специфическая двуцепочечная ДНК (тот самый вирус). У мишени есть протоспейсер - в точности соответствует спейсеру. Вне его примыкает к мишени специальный мотив – мотив Pam. Происходит специфическое узнавание с образованием R-петли (это значит, что есть РНК-ДНК дуплекс, а есть одноцепочечная ДНК). После этого привлечение не очень понятно каким образом фермента Cas3 (эндонуклеаза одноцепочечная и хеликаза), затем происходит удаление мишени.

Cas белки очень разнообразны, целый ряд семейств. Самые консервативные – Cas1 и Cas2, они есть во всех системах. Но они для интерференции не нужны. Если их убрать, то вирус будет убит.

Выживают вирусы, если есть мутация в Pam или рядом. Достаточно одного мисматча в этих местах, чтобы система перестала работать.

На кишечной палочке ничего это не работает (чтобы становились устойчивы к вирусу из-за этой системы). Но на ней все исследования, так как она – удобный модельный организм. Ее заражают фагом М13 (одноцепочечное колечко входит в клетку, строится вторая цепь, дальше как катящееся колесо, потом они пакуются).

Промоторы колийных генов связаны с белком hns, который сидит там плотно и не дает им работать. В специальной экспериментальной системе вводятся работающие промоторы, после чего можно включить Cas3 и весь оперон тогда, когда нам нужно. Нетаргетирующие клетки (наивные) – естественный набор спейсеров. А есть таргетирующие клетки – синженерены, синий спейсер у них есть (соответствует участку в фаге М13). Если все работает как надо, то должна образоваться КРИСП РНК, соответствующая синему спейсеру, которая узнает соответствующий протоспейсер фага, если нет мутаций в Pam (если ATG в Pam, хорошо, иначе ничего работать не будет).

Таргетирующие клетки – вируса почти нет, встречаются лишь редкие (эффективность размножения вируса 10 в пятой при переходе с таргетирующей чашки). В итоге – это конечно результат мутаций (в Pam или в прилегающем участке).

Явно распределение мутаций, которые влияют, неравномерное. Сначала ведь думали, что любая мутация между протоспейсером и спейсером нарушает действие системы. Но похоже это не так. Другое объяснение – может просто вирусы с другими мутациями (не в Pam и рядом) дохлые.

Надо сделать мутантных вирусов по всему участку.

То, что растет и содержит мутации (вирусы) – escape. От +8 можно получать escapы. А в других местах escapы получать нельзя.

Потом можно померять константу диссоциации комплекса КАСКАД с КРИСП РНК с разными мутацими (по оси ординат – процент связывания, по оси абцисс – концентрация чего-то (неважно чего). И кривые получаются, как когда определяем константу Михаэлиса, при этом, чем выше кривая, тем лучше связываются). Константа связывания – половина от максимального прохождения реакции. Константа измеряется в концентрациях.

Все мутации, которые красные – сильно нарушает связывание (слайд 7, связывание – серые столбики).

Получилась куча мутаций, которые ни на что не влияют.

Это все негомологично системе РНК-интерференции. Но этот опыт показывает, что есть SEED, основное требование к которому, что там идентичность между протоспейсером и спейсером должна быть полная. В другом участке (подальше от Pam – там может быть до 4 мисмэтчей, если 5ый, то escape фенотип вируса).

То есть модель поиска мишени работает так: сначала комплекс проверяет есть ли Pam и есть ли точное соответствие с seed, затем инициация, потом образование полного комплекса (реально содержит продукт длиной 32 нуклеотида). Может быть до 4 мисмэтчей. Мы делаем систему защиты от вирусов. Если бы 1 мисмэтч и сразу все выключается, то это бы почти не работало. Так задача для вируса усложняется.

Система очень сходна с РНК-интерференцией.

Так легче, сначала ищется что-то хоть немного похожее, а потом все плавится до конца. Во всех такого рода процессах все так (слайд 8 посмотрите пожалуйста, а то рисунки как-то криво копируются).

Сравнение с РНК-интерференцией:

Существенно, что в РНК-интерференции РНК всегда закодирована в геноме в коротком виде, она всегда там есть. У нас похоже все. Но наша система не таргетирует РНК, только ДНК. Но все-таки все не совсем так. Белки совсем другие.

Гетерогенность по малым РНК не очень большая. У бактерий локусы КРИСП гипервариабельные, так как они еще работают и в адаптации: чтобы защититься от вируса, надо получить спейсер, соответствующий этому вирусу. Чтобы стать устойчивой, надо стать зараженной. Наивные клетки приобрели синий спейсер с помощью генной инженерии, а как в природе?

Есть несколько проблем. Процесс по идее должен быть чисто Ламарковским, так как можно стать устойчивым, только если заразиться, а значит, получается мутагенез под действием внешних условий. Другая проблема – мы вставляем из вируса кусок ДНК, мы хотим иметь возможность, когда надо вставлять туда ДНК из нужного вируса. Первым делом для этого надо вставить туда собственную ДНК, а это приведет к самоубийству.

На картинке ДельБрюк и Лурия. ДельБрюк – в 32 году с Тимофеевым-Рисовским (я правильно написала фамилию?) померяли размер гена. Было параллельно придумано, что рентгеновские лучи вызывают мутацию. Рентгеновские лучи вызывали мутацию у дрозофилы. Так же, как померяли размер ядра. Облучали рентгеном атомы и смотрели, сколько проходит мимо. Просто сравнить долю падающего и исходящего излучения и разделить на моли атомов, которые там были. Эти люди – светили на мух рентгеном и меряли дозовую зависимость возникновения мутаций. И пришли к тому, что ген имеет размер около 100нм.

Вот эти двое сделали флуктуационный тест. И еще куча всего.

Так вот, флуктуационный тест – изучали, как возникают мутации у бактерий. Многие думали, что бактерии пластичные и могут меняться под действием внешних условий. Изучали мутации Е.Коли. На чувствительные бактерии наливалось куча вирусов и бактерии дохли. Но с небольшой частотой появлялись колонии, то есть устойчивые клетки. И это наследовалось. Какой может быть механизм? Либо индуцированные мутации – ламарковские, либо спонтаные мутации – дарвиновский механизм (в разные моменты времени, спонтанное возникновения вариантов).

Получили, что все дарвиновское (В).

Написали работу про то, какая эволюция. Дихотомия: дарвиновский механизм в том, что рандомные мутации в генах (мутации – черточки, они возникают, когда Бог бросает кости). Через сито селекции проходят только полезные мутации. Ламарковский механизм – как жираф тянет шею, направленные мутации, которые включаются в нужный момент. Вроде КРИСПы Ламарковские, но нет, все-таки Дарвиновские.