ВНИМАНИЕ!!! Бромистый этидий – это канцероген! Работа с ним осуществляется исключительно в нитриловых перчатках!

7. Провести окрашивание в течение 20 – 30 мин при комнатной температуре. После окрашивания гель необходимо промыть в дистиллированной воде для удаления излишков красителя. Затем поместить гель в систему гель-документации ChemiDoc, в котором фрагменты ДНК идентифицируются в длинноволновом ультрафиолетовом свете.

1. Оценить размеры рестрикционных фрагментов, используя в качестве стандартаGeneRuler™ 1000 п.н. ДНК-маркер, и определить наличие или отсутствие вставки в выделенной плазмидной ДНК.

Рис.3. Электрофореграмма ДНК GeneRuler™ 1000 п.н. в 1%-м агарозном геле

Задание 2. Определение концентрации двуцепочечной ДНК в растворе. Гиперхромный эффект.

Пуриновые и пиримидиновые основания поглощают в ультрафиолетовой области спектра с максимумом при 260 нм. При этой же длине волны наблюдается и максимальное поглощение ДНК. Эмпирически определено количественное соотношение между концентрацией двуцепочечной ДНК в растворе и величиной оптического поглощения при 260 нм:1единица оптического поглощения соответствует концентрации 50 мкг/мл двуцепочечной ДНК при пробеге 10 мм. Полезно знать отношение величин оптических поглощений при 260 и 280. Данное соотношение может служить показателем присутствия примесей белка в полученном препарате ДНК. Величина отношения 1,7 и более свидетельствует о высокой степени чистоты препарата ДНК.

Денатурация ДНК. Раствор высоко очищенной двуцепочечной ДНК обладает при рН 7 и 25ºС очень высокой вязкостью. При нагревании раствора до 70 - 80ºС или добавлении концентрированной кислоты или щелочи вязкость раствора ДНК резко снижается. Это связано с разрывом водородных связей между комплементарными основаниями и переходом ее в одноцепочечную форму. Процесс нарушения вторичной структуры ДНК, сопровождаемый разрывом двойной спирали, называется денатурацией, или плавлением, и происходит очень быстро при строго определенной температуре

Температурой плавления (Т_пл) называется та температура, при которой разрушается половина водородных связей.

Данный показатель является важной характеристикой молекул ДНК. Т_пл существенно зависит от длины молекулы ДНК и ее нуклеотидного состава, а также от ионной силы раствора. Зависимость Т_пл от длины молекулы может быть выражена формулой:

1/Т_пл = А + В/N,

где N – длина цепи ДНК, А и В – константы, уникальные для каждой экспериментальной системы. Данное выражение справедливо для коротких олигонуклеотидов до 20 пар нуклеотидов длиной. Более длинные цепи имеют мало отличающиеся Т_пл.

Помимо уменьшения вязкости денатурация ДНК сопровождается резким изменением и других физических свойств. Так, увеличивается отрицательный угол вращения плоскости поляризации; увеличивается плавучая плотность (положение молекулы ДНК в градиенте плотности хлористого цезия при ультрацентрифугировании); резко возрастает поглощение света при 260 нм. Такое возрастание поглощения называется гиперхромным эффектом и может быть использовано в качестве экспериментального критерия денатурации ДНК и определения точки плавления (рис.4).

Рис.4. Наблюдение гиперхромного эффекта при длине волны 260 нм при денатурации ДНК

Ход работы:

1. Приготовить пробу следующего состава: к 1,5 мл раствора ДНК (из эритроцитов кур) прибавить 1,5 мл буфера ТЕ (10 мМ трис-НС1, рН 8,0, 1 мМ ЭДТА, рН 8,0). Пробу тщательно перемешать.

2. Провести измерения образца на приборе BioPhotometer plus (Eppendorf). Занести в протокол следующие показания прибора: поглощения при длинах волн 260 и 280 нм, отношение А₂₆₀/ А₂₈₀, концентрацию ДНК. Пробу слить обратно в пробирки (для следующего задания). В качестве спектрофотометрического контроля (Blank) использовать буфер ТЕ.

3. Пробу (3 мл раствора двуцепочечной ДНК после измерений концентрации) кипятить на водяной бане 15 мин. При этом происходит денатурация ДНК.

4. Пробы быстро (для предотвращения ренатурации) опустить в ледяную баню и охлаждать в течение 5 мин.

5. Провести измерения образца на приборе BioPhotometer plus (Eppendorf).Занести в протокол значение поглощения при 260 нм

6. По полученным данным: а) рассчитать значение концентрации ДНК в исходном препарате; б) вычислить изменение величины оптической плотности (ΔА₂₆₀) при денатурации для препарата ДНК, используя результаты, полученные в п.2 и п.5.