Количественный анализ в спектроскопии биомолекул

Практически измерение спектров поглощения сводится к оценке доли излучения, поглощённой в объёме определённой толщины для разных длин волн. В качестве примера рассмотрим кювету с раствором какого-либо вещества известной концентрации С. Толщина кюветы l. Пусть на кювету падает монохроматический световой луч интенсивности I₀, а интенсивность луча, прошедшего через кювету и измеренного с помощью фотоприёмника, равна I_l (рис. 13).

Рисунок 13 – К объяснению закона Ламберта-Бера (объяснения в тексте)

Количественный анализ в спектрофотометрической практике основан на использовании закона Ламберта-Бера:

где I₀ – интенсивность падающего света (квант с^-1);

I_l – интенсивность света, прошедшего через раствор или пленку образца;

D – поглощение раствора (безразмерная величина) или оптическая плотность или экстинкция,

e - коэффициент молярной экстинкции, отнесенной к единице толщины поглощающего слоя (1 см) и единице концентрации исследуемого раствора c=1 моль/л;

l-толщина поглощающего слоя.

Из последнего уравнения ε=D/cl [л/моль см]. Коэффициент экстинкции e является постоянной величиной для данного соединения при данной длине волны. Этот коэффициент и определяет поглощательную способность того или иного вида молекул и её зависимость от длины волны света, т.е. спектр поглощения ε=f(λ). Спектр поглощения является «паспортом» вещества, благодаря которому возможна идентификация соединений. При больших значениях e удобно пользоваться его логарифмом lg e. В некоторых случаях, если концентрация велика, e становится функцией С и тогда можно сказать, что закон Бера нарушается. Это может быть результатом рассеяния света или структурных изменений (например, димеризации, агрегации или химических изменений) при высоких концентрациях.

Между поглощением (D) и пропусканием (Т) существует следующая зависимость:

Величина Т измеряется в долях единицы или в процентах. Из формулы D=lg(1/T).следует, что в то время как значения Т заключены в пределах от 1 до 0, величина D может изменяться от 0 до 2.

Измерение поглощения осуществляют с помощью спектрофотометра. Несмотря на различия в конструкции, все спектрофотометры состоят из источника света, монохроматора (для выделения определенной длины волны), прозрачной кюветы, куда помещается образец, детектора света и измерительного прибора или самописца для регистрации выходного сигнала детектора. Ход работы обычно следующий: измеряют при одной длине волны интенсивность света, прошедшего через растворитель (который может быть буфером), затем следует измерение интенсивности света, прошедшего через раствор изучаемого вещества в том же растворителе Далее фиксируется изменение в интенсивности света, по которому можно судить о поглощении растворенного вещества. На практике прибор настраивают таким образом, чтобы он показывал нулевое поглощение при измерении одного растворителя (это называется настройкой прибора на нуль). Осуществив такую настройку, можно снимать показания, соответствующие непосредственно поглощению образца.

Для получения спектра эта операция повторяется при многих длинах волн. Некоторые приборы, называемые автоматическими двухлучевыми регистрирующими спектрофотометрами, позволяют осуществлять развертку длин волн и одновременно измерять поглощение образца и растворителя (которые находятся и различных кюветах) и фиксировать с помощью электронного оборудования суммированный поток излучении.

Однако при работе в коротковолновой области вплоть до 1800 Ǻ необходимо принимать меры, чтобы избежать помех, связанных с поглощением света кислородом. Достигнуть этого довольно легко, если заполнить всю оптическую систему газообразным азотом. В области еще более коротких волн необходимы специальные вакуумные ультрафиолетовые спектрофотометры, в которых применяются дифракционные решетки. Часто возникает потребность снять спектр поглощения биополимера при различных температурах. Тогда используют специальные термостатированные кюветы. В них кювета с образцом помещена в специальный держатель, где постоянная температура поддерживается в результате циркуляции жидкости из термостата. Чтобы предотвратить испарение легколетучих растворителей, кварцевые кюветы снабжают крышками. При длинах волн, близких к вакуумной ультрафиолетовой области (l<2000 А), поглощение растворителей становится достаточно интенсивным, и желательно, чтобы длина кюветы была по возможности невелика.

Наиболее важными параметрами спектров поглощения служат: положения максимумов спектра на шкале длин волн (λ_макс, нм), полуширины полос поглощения Δλ_1/2 (измеряются на половине высоты максимума), величины максимумов D_макс, а если их несколько, то и соотношение между ними.

Современные двухлучевые спектрометры позволяют непосредственно записывать поглощение или пропускание. Спектры поглощения строятся так, что на ординате откладывается поглощение (D) (или lg e) или пропускание (T), а на оси абсцисс – длина волны l.

Как видно из сказанного выше, по измеренной на спектрофотометре оптической плотности D при известных ε и l можно определить концентрацию вещества

С=D/(εl).

Обычно оптическую плотность измеряют при длине волны, соответствующей максимуму поглощения. Наибольшая точность измерений достигается при оптической плотности 0,43. Точность измерения падает при слишком больших и при слишком маленьких поглощениях (таблица 3).

Таблица 3. Связь оптической плотности при длине волны 260 нм с точностью измерений.

D260	Точность, %
~ 0,005	~ 18
~ 0,01	~ 9
0,3-0,7	~ 0,3
0,1-1,0	~ 1,0

Если в исследуемом объёме имеется несколько веществ, поглощающих в одной и той же спектральной области, то для оптической плотности выполняется закон аддитивности для каждой длины волны (рис. 14)

D_AB= D_A+D_B,

для пропускания

Т_AB= Т_AТ_B.

1,2 –спектры компонентов; 3 – спектр смеси.

Рисунок 14 – Количественный спектрофотометрический анализ смеси двух веществ

Измерение спектров поглощения биологических препаратов существенно отличается от измерения растворов веществ. Неравномерное распределение вещества по объёму (например, весь хлорофилл суспензии находится только в хлоропластах и т.п.) приводит к тому, что часть света проходит мимо частиц не поглощаясь. Такой эффект называемый эффектом сита, увеличивает интенсивность прошедшего света I, а следовательно и светопропускание Т (D падает).

Вследствие гетерогенности биологических образцов часто появляется сильное светорассеяние. Это часто связано с различными коэффициентами преломления среды и частиц препарата. Рассеянный на границах раздела фаз «среда–частица» свет не попадает на фотоприёмник, вызывая кажущееся падение I (Т падает, а D возрастает).

Совместное действие светорассеивания и эффекта сита искажает измеряемый спектр поглощения, сглаживая максимумы и уширяя полосы поглощения. Чтобы избежать этого, необходимо использование более тонких и гомогенных образцов, а также сред с более близкими к частицам коэффициентами преломления (например, добавление 60 % глицерина к водным суспензиям частиц или клеток).

Метод УФ-спектроскопии используют как для идентификации веществ (например, оснований аденин, тимин, гуанин, цитозин в нуклеотидном составе ДНК), так и для количественного анализа. Например, для определения содержания ДНК в бактериофагах или концентраций бактерий. В спектре ДНК максимум поглощения λ_макс приходится на длину волны около 260 нм, а ε=6600, однако, индивидуальные основания имеют λ_макс (в нм): 260,5 для аденина; 264,5 для тимина; 246 для гуанина и 267,0 для цитозина. Величины ε оснований при λ_макс 13,4×10³ , 7,9×10³ , 10,7×10³ , 6,1×10³ соответственно.

Лабораторная работа №1. Изучение принципа и порядка работы на спектрофлуориметре «Флюорат-02 Панорама»

Цель работы – проведение спектральных измерений на спектрофлуориметре «Флюорат-02 Панорама».

Анализатор «Флюорат-02-Панорама» является классическим исследовательским спектрофлуориметром, позволяющим производить различные спектральных и хроматографических измерения, измерения кинетики затухания люминесценции, хеми- и биолюминесценции. Кроме того, анализатор позволяет проводить измерения массовой концентрации веществ в соответствии с утверждёнными методиками (рис.15). Таким образом, одной из возможностей данного анализатора является проведение спектральных измерений.

Рисунок 15 – Спектрофлуориметр «Флюорат-02 Панорама».

Принцип действия установки основан на измерении опорным приёмником уровня мощности излучения определенной длины волны, выделяемой с помощью монохроматора. Селекция световых потоков осуществляется специально подобранными светофильтрами. В качестве источника света используется импульсная ксеноновая лампа высокого давления, обеспечивающая достаточно интенсивные световые потоки во всем спектральном диапазоне. Измерение длины волны источников излучения проводится путём измерения распределения мощности по спектру и последующим определением длины волны в максимуме полученного спектра.

Для проведения спектральных измерений необходимо выбрать пункт Спектральные в меню Измерения или нажать на кнопку линейки инструментов, что приводит к появлению окна спектральных измерений (рис.16).

На вкладке Измерение рабочей панели можно выбрать:

· Тип сканирования.

· Параметры сканирования в соответствии с выбранным типом.

· Параметр усреднения.

· Количество отображаемых графиков.

· Режим математической коррекции.

В зависимости от задаваемых монохроматору возбуждения и регистрации величин возможны четыре типа сканирования: по возбуждению, по регистрации, синхронное и с переменным углом (табл. 4).

Рисунок 16 – Рабочее окно спектральных измерений.

Таблица 4. Значения параметров сканирования для различныз типов сканирования.

Тип сканиро вания Пара метры сканирования	Сканирование по возбуждению	Сканирование по регистрации	Синхронное сканирование	Сканирование с переменным углом
монохроматор возбуждения	спектральный диапазон (поля От и До) и Шаг,	постоянную длину волны	спектральный диапазон (поля От и До) и Шаг	спектральный диапазон (поля От и До) и Шаг
монохроматор регистрации	постоянную длину волны	спектральный диапазон (поля От и До) и Шаг.	единицы Смещения	спектральный диапазон (поля От и До

Параметр усреднения задает количество элементарных измерений (вспышек лампы), результат которых будет усредняться для вывода одной точки графика. С увеличением параметра усреднения уменьшается уровень шума, но растет полное время сканирования.

Создание и редактирование программ спектральных измерений осуществляется на вкладке Программа. Программа спектральных измерений позволяет в процессе сканирования изменять параметры прибора. Кроме того, имеется возможность уменьшить время измерения, указав в этапах программы только информативные участки в спектральном диапазоне.

Во время создания программы необходимо выбрать один из перечисленных выше типов сканирования. Затем, для каждого этапа программы, в соответствии с типом сканирования, задаются параметры изменения длин волн возбуждения и регистрации, а также задержка и длительность строба, чувствительность ФЭУ и число вспышек для усреднения.

На панели Обработка окна спектральных измерений имеется функция Поиска пиков, которая позволяет обнаруживать не только максимумы, но и минимумы, что может быть полезно при анализе результатов фотометрических измерений.

Ход работы:

1. Для начала работы необходимо включить питание прибора.

2. Запустить программу на компьютере и задать параметры измерения.

Для проведения спектральных измерений необходимо выбрать пункт Спектральные в меню Измерения. Установить спектральный диапазон (От 200 до 350). В меню каналы установить флажок в графе фотометрия и тип коррекции по опорному. Выбрать тип сканирования по возбуждению.

3. Установить кювету с контрольным раствором в кюветное отделение прибора и запустить измерение.

4. .В поле графика по щелчку правой кнопки мыши выбрать копировать далее для обработки.

5. Перейти в окно Обработка вверху панели и в поле графика щелчком правой кнопки мыши выбрать вставить.

6. Вернуться в окно Измерения и измерить спектр пропускания опытного образца.

7. Скопировать результаты сканирования в окно Обработка.

8. В этом окне для получения спектра поглощения необходимо провести обработку результатов, выбрав функцию f(x)=log(x), и провести расчет относительно эталонного раствора по формуле log(A/B), где A – это спектр пропускания контрольного раствора (вода), а B – спектр пропускания опытного образца.

9. Экспортировать данные в Excel, построить график функции оптической плотности от длины волны. На основе полученных результатов сделать выводы.