Иммунды ферментті анализ, ИФА
Зертгелетін материалдың құрамындағы микробтың антигенін немесе сарысуындағы антиденелерді анықтауға мүмкіндік беретін - бұл қатты фазалық иммунды ферментті анализ (қатты фазалық иммунды сорбентті анализ).
Тапсырма 3.
Микробтардың антигендерін ИФА бойынша анықтау
Ингредиенттері: полистиролды планшеттердің ойықтарына бекітілген белгілі антиденелер; құрамында микробтың антигені бар зерттелетін материал; зерттелетін микробтың антигеніне пероксидазамен (Пх) белгіленген специфихалық антиденелер; ортофенилендиамин (Оф, бұл түссіз сұйық хромоген, бірақ пероксидазамен байланысса қоныр түсі пайда болады).
Полистиролды пробиркалардың қабырғасына белгілі антигенге қарсы антиденелерді (антидене қарсы антитенді) жабыстырады, зерттеуге арналған затты енгізеді, 30-40 мин 37°С инкубацияланады. Детергент қосылған арнайы буферлы ертіндімен ойықтар шайылады.
Техникасы, кезендері: 1. Белгілі антиденелер бекітілген полистиролды планшеттін ойықтарына микробтың антигені бар зерттелетін материал енгізіледі. 30-40 мин. 37°С инкубацияланады. Детергент қосылган арнайы буферлы ертіндімен ойықтар шайылады.
2. Пероксидазамен белгіленген антиденелер ойықтарға енгізіледі. 30-40 мин 37°С инкубацияланады. Детергент қосылған арнайы буферлы ертіндімен ойықтар шайылады.
3. Ортофенилендиамин қосылғаннан кейін планшеттер бөлменің қаранғы орында 20 мин. ұсталады. Қатты фазалы ИФА нәтижесі спектрофотометр Мультискан арқылы есептеледі.
Нәтижелері: зерттелетін материалдың құрамында микробтың антигендері болғанда олар ойықтардың түбіндегі антиденелермен байланысады. Пх белгіленген антигендерімен байланысады. At + Ag - Пх комплексі түзіледі. Ақырғы кезенде ойықтарға енгізілген Оф Пх-мен байланысып қоңыр түсті болады. Бұл нәтижелі реакция.
Егер зерттелетін материалда микробтың антигендері болмаса, онда буфермен шайғаннан кейін ойықтардың түбінде тек ғана белгілі антиденелер орналасады. Содан кейін енгізген Пх-мен белгіленген антиденелерде ойықтардан буфермен шайылып кетеді. Реакцияның аяғында Оф түссіз боп қалады. Бүл нәтижесіз реакция.
б) Спецификалық антиденелерді анықтау
Ингредиенттер: полистиролды планшеттердің ойықтарына бекітілген белгілі микробты антигендер; зерттелетін сарысу; пероксидазамен бекітілген белгілі микробты глобулинге қарсы сарысу; ортофенилендиамин.
ИФА қою техникасы, кезендері: 1. Белгілі микробтың антигендері бекітілген полистиролды планшеттің ойықтарына зерттелетін сарысу еңгізіледі. 30-40 мин. 37°С инкубацияланады. Детергент қосылған арнайы буферлы ертіндімен ойықтар шайылады.
Пероксидазамен белгіленген АГС ойықтарға енгізіледі. 37°С 30-40 мин. инкубацияланады. Детергент қосылған арнайы буферлы ертіндімеи ойықтар шайылады.
3. Ортофенилендиамин қосылғаннан кейін планшеттер бөлменің қараңғы орында 20 мин. ұсталады.
4. Қатты фазалы ИФА нөтижесі спектрофотометр Мультискан арқылы есептеледі
Нөтижелері: зерттелетін сарысудын құрамында антиденелер болғанда ойықтардың түбіндегі антигендермен байланысады және буферлы ертіндімен шайылып кетпейді. Содан кейін енгізілген АГС - Пх ойықтардың түбінде қалады. Ag + At + АГС - Пх комплексі түзіледі. Енгізілген Оф Пх-мен байланысып қоңыр түсті болады. Бұл нәтижелі реакция.
Егер зерттелетін сарысудың құрамында антиденелер болмаса, онда ойықтардың түбінде тек ғана алдын ала бекітілген микробтың антигені қалады. Содан кейін енгізілген АГС - Пх буферлы ертіндімен шайылып кетеді, ал Оф түссіз боп қалады. Бүл нәтижесіз реакция.
Радиоиммунды анализ, РИА
Зерттелетін материалдың құрамындағы антигенді, сондай-ақ сарысудың құрамындағы антиденелерді анықтауға бағытталған зерттеу әдісі.
РИА өткізу үшін антиген немесе антидене радиоизотоппен танбаланады және полистиролды планшеттін ойықтарының түбіне бекітіледі.
Микробтың антигенін анықтау үшін ойықтардың түбіне изотоппен таңбаланған антиделер бекітіледі. Содан соң бекілген антиденелерге құрамында микробтың антигені бар зерттелетін материал қосылады. Антиген-антидене комплексі түзілгеннен кейін ойықтарға изотоппен таңбаланған микробтың антигені қосылады. Таңбаланған микробты антиген тек ғана алдында енгізілген антигенмен байланысқаннан кейін қалған антиденелердің активті орталықтарымен қосылады. Ойықтардың түбінде қалған антигеннің пайзын немесе изотоптың мөлшерін есептеу арқылы әдістің нөтижесі бағаланады.
Тақырыбы: Жұқпалы аурулардың иммунопрофилактикасы және иммунотерапиясы. Иммунопатология (Иммунодефицитті жағдай, жоғары сезімталдық реакциясы, аутоиммундық процестер).