Методы микроскопического исследования препаратов
1.световая микроскопия предназначена для изучения окрашенных препаратов на предметных стеклах, можно исследовать подвижность микроорганизмов.
2. Возможности светового микроскопа ограничены слишком большой длиной волны видимого света (около 0,55 мкм). Поэтому частицы, диаметр которых меньше этой величины, невидимы. Для исследования таких мелких частиц используют электронный микроскоп
Источником электронов является раскаленная вольфрамовая нить. Роль линз выполняет круговое магнитное поле. Магнитная линза фокусирует первый пучок электронов, прошедший через объект, в первое действительное изображение, увеличенное примерно в 200 раз. Магнитный промежуточный проектор увеличивает первое изображение приблизительно еще в 250 раз. Т. о, общее увеличение объекта - 50 000. Поскольку воздух препятствует движению электронов, внутри микроскопа необходимо поддержать вакуум. Для откачивания воздуха существуют специальные приспособления. Исследуемый объект предварительно фиксируют смесями, которые содержат четырехокись осмия. Затем объект исследования наносят на тонкую коллодиевую, формваровую или целлюлозную пленку толщиной 0,000001 см, которую предварительно накладывают на специальные подложки. Для определения деталей структуры микроорганизма используют специальные методы — напыление и негативное контрастирование.
Метод напыления. На поверхность препарата под определенным углом напыляют тонким слоем в 7 нм различные тяжелые металлы: хром, золото, палладий. Напыление производят в вакууме. Частички металла в виде паров оседают на возвышающихся участках поверхности исследуемого микроорганизма. Этим достигаются рельефное проявление деталей исследуемого объекта и возможность определения различий между ними.
Метод негативного контрастирования. Препарат красят растворами, содержащими атомы тяжелых металлов, напр. фосфорно-вольфрамовую кислоту. Осаждаясь около белковых частиц и заполняя все имеющиеся пространства и трещины, атомы тяжелых металлов создают «окрашенный» фон, на котором выявляются мельчайшие детали строения микроорганизмов.
3.темнопольная микроскопия- основана на явлениях рассеяния света при сильном боковом освещении взвешенных в жидкости частиц. Позволяет увидеть более мелкие частицы, чем в световом микроскопе. Осуществляется с помощью светового микроскопа, снабженного специальными конденсорами, который создает полый конус света. Вершина этого полого конуса совпадает с объектом. Лучи света, проходя через объект исследования в косом направлении, не попадают в объектив микроскопа. В него проникает только свет, рассеянный объектом. Поэтому на темном фоне препарата наблюдаются ярко светящиеся контуры микробных клеток и других частиц. Микроскопия в темном поле зрения позволяет определить форму микроба и его подвижность. Используют при исследовании микроорганизмов, которые слабо поглощают свет и не видны в световом микроскопе, как, например, спирохеты.
4. Метод фазово-контрастной микроскопии (ФКМ) основан на том, что живые клетки и микроорганизмы, слабо поглощающие свет, но способны изменять фазу проходящих через них лучей (фазовые объекты). В разных участках клеток, отличающихся показателем преломления и толщиной, изменение фаз будет неодинаковым. Эти разности фаз, возникающие при прохождении видимого света через живые объекты, видимы с помощью ФКМ. ФКМ осуществляется с помощью светового микроскопа и специального приспособления, куда входят фазово-контрастный конденсор с кольцевыми диафрагмами и фазовая пластинка, имеющая форму кольца. Для первоначальной наводки используют вспомогательный микроскоп, с помощью которого добиваются того, чтобы через кольцевую диафрагму конденсора в объектив проникало лишь кольцо света. Луч света, пройдя через прозрачный объект, расщепляется на два луча: прямой и дифрагированный (преломленный). Прямой луч, проникнув через частицу, фокусируется на кольце фазовой пластинки, а дифрагированный луч как бы огибает частицу, не проходя через нее. Поэтому оптические пути их различны и между ними создается разность фаз. Она сильно увеличивается с помощью фазовой пластинки и благодаря этому контрастность изображения повышается, что позволяет наблюдать не только фазовые объекты целиком, но и детали строения, например, живых клеток и микроорганизмов.
5. Люминесценцией (или флюоресценцией) называют излучение клеткой света за счет поглощенной энергии. Большинство микроорганизмов приобретает способность люминесцировать, или флюоресцировать, при освещении их ультрафиолетовыми лучами после предварительной окраски— флюорохромами (аурамин, корифосфин, флюоресцеин). Поглощая короткие ультрафиолетовые волны, объект излучает более длинные волны видимой части спектра. Вследствие этого разрешающая способность микроскопа повышается. Это дает возможность исследовать более мелкие частицы.
6. Поляризационная микроскопия основана на явлении поляризации света и предназначена для выявления объектов, вращающих плоскость поляризации. Применяется в основном для изучения митоза.
7. В основе ультрафиолетовой микроскопии лежит способность ДНК, РНК поглощать УФ-лучи. Она дает возможность наблюдать и количественно устанавливать распределение этих веществ в клетке без специальных методов окраски. В ультрафиолетовых микроскопах используется кварцевая оптика, пропускающая ультрафиолетовые лучи.
7.Интерференционная микроскопия-в интерференционном микроскопе падающие на объект световые пучки раздваиваются — один пучок проходит через объект, другой — идет мимо. При последующем воссоединении пучков возникает интерференционное изображение объекта. По сдвигу фаз одного пучка относительно другого можно судить о концентрациях различных веществ в исследуемом объекте.