Использование интеркалирующих агентов.
Этот способ детекции основан на том факте, что флуоресценция бромистого этидия и SYBR Green I значительно возрастает при их внедрении в двухцепочечные молекулы ДНК [4]. Таким образом, можно наблюдать за накоплением продуктов амплификации.
Очень важно отметить то, что увеличение флуоресценции может быть связано как с накоплением специфического продукта, так и неспецифического (праймеры-димеры, шмер). Для получения корректных результатов необходимо дополнительное изучение полученных ампликонов с помощью построения так называемых "кривых плавления" (melting curves).
22.ДНК-микрочип (англ. DNA microarray) — технология, используемая в молекулярной биологии и медицине. Современный ДНК-микрочип состоит из тысяч дезоксиолигонуклеотидов (зондов, или проб), сгруппированных в виде микроскопических точек и закреплённых на твёрдой подложке. Каждая точка содержит несколькопикомолей ДНК с определённой нуклеотидной последовательностью. Олигонуклеотиды ДНК-микрочипа могут быть короткими участками генов или других функциональных элементов ДНК и используются для гибридизациис кДНК или мРНК (кРНК). Гибридизация зонда и мишени регистрируется и количественно характеризуется при помощи флюоресценции или хемилюминесценции, что позволяет определять относительное количествонуклеиновой кислоты с заданной последовательностью в образце.
В обычном ДНК-микрочипе зонды ковалентно прикрепляются к твёрдой поверхности — стеклянному или кремниевому чипу. Другие платформы, например, выпускаемые Illumina, используют микроскопические шарики вместо больших твёрдых поверхностей.
ДНК-микрочипы используют для анализа изменения экспрессии генов, выявления однонуклеотидных полиморфизмов, генотипирования или повторного секвенирования мутантных геномов. Микрочипы отличаются по конструкции, особенностям работы, точности, эффективности и стоимости
Printed (spotted) microarrays
"В этих ДНК-чипах пробы были изготовлены с помощью химического синтеза олигонуклеотидов и затем крепится к элементам массива. Пробы наносились иглой в наперед заданные точки подложки или печатались на мелкую сетку подложки принтером, который использовал ту же технологию печати, что и струйный принтер, но вместо капель чернил использовались капли проб нано- или пиколитрового объема."[4][5]
In-situ synthesized
"Такие микрочипы сделаны с использованием фотолитографии. Процесс выглядит следующим образом: на подложке находятся ковалентные молекулы-линкеры с защитной группой на свободном конце, которая может быть удалена с помощью света. УФ-свет направляется через фотолитографическую маску, снимает защиту и активирует выбранные сайты с гидроксильными группами, которые инициируют сцепление с защищенными нуклеотидами, которые крепятся к активированным сайтам. Маска разработана таким образом, что можно выбрать сайты экспозиции, и, таким образом, определить координаты в массиве, в которых нуклеотид будет прикреплена. Процесс повторяется, применяется новая маска, активизируя различные наборы сайтов и различные основания, позволяющих необходимым ДНК-пробам быть синтезированным на каждом сайте. Каждая проба на чипе требует четыре маски за раунд синтеза: одну маску для синтеза и три другие маски, чтобы предотвратить снятие защиты в том же месте в то время, как добавляются три других три нуклеотида. В среднем, каждая проба длиной в 25 нуклеотидов требует около 100 масок на чип. Такие микрочипы, как правило, используют несколько проб для каждого гена для повышения специфичности и поиска снипов."[4][5]
High-density bead arrays
«Технология Illumina BeadArray основана на цветокодированных 3-мкм кварцевых бусинах, которые случайным образом распределяются на слайде из кварцевого стекла или субстрате из волоконно-оптических пучков, который собираются в массив. Бусины расположены друг от друга на расстоянии 5.7 мкм и, таким образом, достигается с плотностью упаковки в 40000 элементов массива на квадратный миллиметр. Каждая бусина покрыта сотнями тысяч копий специфической олигонуклеотидной последовательности, с которой гибридизуется анализируемая последовательности. Каждый шарик имеет адрес из 23 олигонуклеотидов и пробу длиной в 50 олигонуклеотидов.
В процессе производства массива бусины случайным образом распределяются по субстрату таким образом, что в каждый массив попадает 50000 бусин. Каждый ген представлен двумя последовательностями проб. Серия декодирующей гибридизации используются, чтобы определить, какие олигонуклеотиды присутствуют в каких координатах для каждого массива.»[4][5]
Декодирование BeadArray
Стеклянным шарикам в массиве присвоены адреса. Адрес состоит из последовательности флуоресцентно-помеченных олигонуклеотидов, каждый из которых может иметь три значения — 0 (OFF), 1 (ON — FAM), 2 (ON — Cy3). Самыми частыми ошибками являются ошибке перехода одного из состояний ON в состояние OFF, более редкими — состояния OFF в состояние ON. Самыми редкими являются ошибки перехода одного состояния ON в другое, так как они являются сочетанием двух ошибок — неправильного распознавания одного из состояний ON на одном канале и, в то же время, неправильным распознаванием сигнала ON как сигнала OFF. Для проверки корректности используется код, схожий с кодом Хэмминга. Например, для адреса длиной восемь олигонуклеотидов, в расшифрованном адресе должно быть ровно шесть состояний ON и два состояния OFF. Таким образом, существует 1520 корректных и используемых адресов, 272 корректных и не используемых адресов (они используются для распознавания редких двойных ошибок) и 4769 некорректных адресов
23. Созданные за рубежом компьютерные информационно-диагностические и справочные системы (LDDD, POSSUM, GENDIAG, JMIM и др.) нашли международное признание как медико-генетические банки большого объема информации, включая врожденные пороки развития и хромосомные синдромы. Использование в России иностранных программных продуктов затруднено как за счет невозможности пополнения приобретенных систем собственными оригинальными данными, так и сложностью использования на практике зарубежных инструкций врачами-практиками. Кроме того, невозможность сертификации иноязычных программ, необходимо учитывать специфику популяций и особенности организации медико-генетической службы Российской Федерации. Эти трудности, по-видимому, можно преодолеть. Так, в Японии знания и разработки европейских и американских исследователей по компьютерным базам данных и системам обобщены и адаптированы для пользователей всей страны в привычном иероглифическом и буквенном начертании. Нашли широкое применение в медико-генетической практике следующие наиболее информативные базы данных: 1) MIM (Mendelian Inheritance in Man. V.A. McKusick). Каталог содержит более 13 500 статей, и база его данных ежедневно пополняется. В каталоге представлены данные о молекулярных дефектах при менделирующих заболеваниях, генетические карты человека, описание всех классов менделирующих нарушений (аутосомно-доминантных, аутосомно-рецессивных, Х- и Y-хромосомных генов), список литературы, предметный указатель. Каждый менделирующий признак имеет шестизначный номер (например, фенилкетонурия-М1М 261600). 2) OMD (Oxford Medical Database - Оксфордская медицинская база данных), которая имеет два подраздела - Лондонскую базу данных (London Dysmorphology Database — LDDB), включающую сведения более чем о 2300 нехромосомных синдромах и Лондонскую нейрогенетическую базу данных (London Neurogenetics Database — LNDB), содержащую сведения более чем о 2200 наследственных заболеваниях центральной и периферической нервной системы. Базы данных основаны на сведениях более чем из 1000 научных журналов и постоянно пополняются. Создание баз данных обусловлено необходимостью диагностики и обеспечения медико-генетического консультирования сотен редких синдромов и болезней, которые сопровождаются тяжелыми нарушениями нервно-психического развития детей
В результате четкого описания симптомов, наблюдающихся у конкретного больного, указанные диагностические системы и базы данных позволяют из всего многообразия заболеваний выделить наиболее сходные синдромы по фенотипическим признакам. Врач получает возможность провести дифференциальную диагностику среди ограниченного перечня нозологии, выбрать оптимальный план дальнейшего обследования и лечения больного или использовать информацию для оценки генетического риска (прогноз заболевания). Имеющиеся компьютерные системы диагностики и базы данных оказываются весьма полезными при проведении медико-генетического консультирования и определения риска возникновения наследственного заболевания, а также могут использоваться в научных и учебных целях. Медицинская генетика как сфера практической деятельности мало формализована и поэтому является трудным полем деятельности для внедрения компьютерных технологий. Продвижение компьютеризации проявилось в использовании графического интерфейса, возможности передать изображение. Создаются видеотеки на компакт-дисках с изображениями больных с разнообразными наследственными синдромами. Открылись новые функциональные возможности в получении информационной справки, цитогенетическим сведениям и клиническим характеристикам, включая фотопортрет больного и микрофотографии хромосом. От внедрения высоких научных технологий можно ожидать громадных достижений в прикладном плане. Мировой опыт в прошлом и настоящем показывает, что достижения генетики человека могут быть реализованы в медицине в наилучшем виде и в полной мере только там, где они используются комплексно в совместной работе генетиков и врачей при соблюдении биоэтических и деонтологических норм. В перспективе именно интеграция баз данных с экспертными системами позволит существенно расширить возможности врачей и повысить эффективность диагностических решений
24. методы позволяют достаточно легко осуществлять рекомбинацию in vitro любых фрагментов ДНК. Если один из этих фрагментов в составе гибридных молекул ДНК которая содержит информацию, необходимую для автономной репликации в определенном типе клеток, то другие фрагменты ДНК, ковалентно соединенные с первым, можно амплифицироватъ (размножить) в этих клетках. При выделении чистой культуры из колонии (или вирусной бляшки), выросшей из единичной клетки, которая содержит индивидуальную молекулу гибридной
ДНК, осуществляется клонирование определенного фрагмента ДНК. При этом фрагмент, обеспечивающий репликацию гибридной молекулы ДНК в клетке, называется клонирующим вектором. Такой вектор должен обладать следующими основными свойствами:
• иметь ограниченное (предпочтительно одно) число мест расщепления определенной рестриктазой;
• содержать генетический маркер, который может быть использован для отбора клонов, несущих гибридные ДНК, после введения в чувствительные клетки смеси молекул
• ДНК, полученных в процессе рекомбинации in vitro;
• не должен терять репликативные функции при встройке экзогенного фрагмента ДНК. В качестве векторных молекул в генетической инженерии используют широкий спектр плазмидных и вирусных ДНК. Наиболее популярны клонирующие векторы, несущие несколько генетических маркеров, по которым можно легко отличить исходную векторную ДНК от получаемых гибридов, и имеющие по одному месту действия для нескольких рестриктаз. Кроме того, обычно желательно, чтобы вектор обеспечивал эффективную репликацию гибридных ДНК, так как часто важно иметь в клетке повышенное число копий клонированных генов.
Частным случаем клонирующих векторов являются экспрессирующие векторы. Это молекулярные векторы, которые наряду с амплификацией обеспечивают правильную и эффективную экспрессию чужеродных генов в клетках-реципиентах.
В ряде случаев молекулярные векторы могут обеспечивать интеграцию чужеродной ДНК в геном клетки или вируса. Такие молекулы ДНК называют интегративными векторами.
Векторные молекулы играют важнейшую роль на этапе клонирования in vivo изучаемых последовательностей ДНК. Конкретные векторы будут рассмотрены в дальнейшем для каждой генно-инженерной системы отдельно. Использование клонирующих векторов позволяет получать необходимый фрагмент ДНК в индивидуальном состоянии и в препаративных количествах. Это подняло на качественно новый уровень исследования структурно-функциональной организации геномов как прокариотических, так и эукариотических организмов (см. 1.7). Разработка и совершенствование экспрессирующих векторов позволяет все с большей определенностью создавать штаммы — суперпродуценты чужеродных белков.
25. Как клонирующие векторы в генной инженерии используются плазмиды, вирусы и искусственные хромосомы. Самыми первыми векторами стали бактериальные плазмиды - внехромосомные автономно реплицирующиеся кольцевые молекулы ДНК. Следом для молекулярного клонирования стали использовать вирусы (фаги), которые в природе также могут захватывать и передавать ДНК от клетки к следующей клетке (трансдукция ДНК). Появились различного ряда гибридные векторы, например гибриды фагов с плазмидами - фагмиды (phagemid). Для клонирования больших фрагментов ДНК были сконструированы искусственные хромосомы. . Различные типы клонирующих векторов обладают разным лимитом на размер вставок чужеродной ДНК.
Плазмидные векторы - кольцевые двухцепочечные молекулы ДНК, имеющие клонирующий лимит до ~10 тнп (тысяч пар нуклеотидов). Плазмиды найдены практически у всех исследованных бактерий, у некоторых до ~10 видов разных плазмид, каждая из них выполняет свои характерные функции. Плазмиды также обнаружены у некоторых эукариот, например, у дрожжей -три типа различных плазмид. Некоторые плазмиды можно рассматривать как молекулярных паразитов, но многие кодируют важные функции, например, устойчивость к антибиотикам, тяжелым металлам, способность усваивать определенные вещества. В одной клетке могут сосуществовать только плаз-миды, принадлежащие к разным группам совместимости. Каждая плазмида содержит сайт инициации репликации (ориджин, ori), специфичность которого определяет круг хозяев плазмиды, некоторые могут реплицироваться только в клетках одного вида, другие имеют широкий спектр хозяев. Размеры плазмид варьируют приблизительно от ~1 до 500 тпн. Каждая плазмида имеет постоянную определенную копийность в клетке - количество молекул на клетку. На основе плазмид сконструировано огромное количество различных векторов, поскольку единственным обязательным элементом плазмиды является небольшой сайт инициации репликации, с остальной последовательностью можно проводить любые манипуляции. Схема типичного плазмидного вектора рассмотрена более подробно далее (см. рис. 2.7). Основным недостатком плазмидных векторов является их малая емкость в отношении клонируемых фрагментов ДНК. Выраженное делетирование больших вставок чужеродной ДНК в плазмидах связано с тем, что селективное преимущество в бактериях получают плазмиды с минимальным временем репликации.
Может и не спросит это
Типичный экспрессионный бактериальный вектор обычно содержит следующие элементы.
1.Сайт инициации репликации(ориджин) – необходимый элемент, то, что делает молекулу ДНК вектором и определяет его хозяйскую специфичность. Структура ориджина репликации обуславливает копийность вектора – количество молекул на клетку(1–4для низкокопийных,15–20для обычных и150–200и более для высокопийных векторов), а также его совместимость с другими векторами. В одной клетке могут сосуществовать только вектора с ориджинами репликации из разных групп совместимости..
2.Селективный ген, предназначенный для отличия содержащих ре-
комбинантную конструкцию клеток (трансформированных) от исходных. Чаще всего используют гены устойчивости к различным антибиотикам, например, популярен ген -βлактамазы,придающий устойчивость к ампициллину.
3. Множественный клонирующий сайт(МКС, MCS), состоящий из близкорасположенных уникальных сайтов нескольких эндонуклеаз рестрикции (единственных в данном векторе) для удобства соединения с клонируемой. Иногда его называют полилинкер. В экспрессионную кассету ген вставляется с сохранением имеющейся рамки считывания или с собственным стартовым кодоном (AUG) на определенном расстоянии от рибосомсвязывающего сайта (RBS).
РГАНИЗМЫ
ГЛАВА 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАН.
Рис. 2.7. Общая схема типичного бактериального вектора. Экспрессионная кассета изображена в увеличенном масштабе. МКС – множественный клонирующий сайт, RBS (ribosome binding site) или последовательность Шайн-Дальгарно(SD) – сайт связывания рибосом, обеспечивает связывание прокариотической рибосомы за счет комплементарности3'-концевойчасти 16Sрибосомальной рРНК с матричной мРНК
4. Сигнальные и регуляторные элементы экспрессии(транскрипции с последующим синтезом белка), хорошо работающие в клетке-мишени и необходимые для экспрессии клонированного гена. Прокариотические и эукариотические сигнальные и регуляторные элементы сильно различаются, но среди прокариотических, так же как и среди эукариотических, существуют универсальные элементы, хорошо работающие в широком круге хозяев, и специфические, работающие только в конкретной клетке.
Составной частью любого экспрессионного вектора является экспрессионная кассета (рис. 2.7), которая включает все необходимые сигнальные и регуляторные элементы, Для бактерий это промотор, обычно строго регулируемый, регуляторные элементов транскрипции и трансляции (в том числе энхансеры и структуры, стабилизирующие мРНК), сайт связывания рибосом, терминаторы трансляции и транскрипции.
5.Ген-репрессор транскрипциис векторного индуцибельного промотора, часто вводимый в состав векторов для более сильного ингибирования синтеза целевого белка в отсутствие индукции. Особенно это актуально при клонировании токсичных дляклетки-хозяинабелков. Наличие в составе векторагена-репрессоратранскрипции позволяет строже регулировать синтез клонированной ДНК и не зависеть от клеточной регуляторной системы.
6.Дополнительные фрагменты для экспрессии целевого гена в виде фьюжинов. В состав экспрессионной кассеты часто вводят различныеэпитопы, при этом целевой белок синтезируется в виде N- илиC-концевогофьюжина (гибридного белка). Цели могут быть различными – повышение уровня экспрессии целевого белка, его стабильности, улучшение его растворимости и сворачиваемости в нативную конформацию и другие, но чаще всего такие эпитопы (таги) вводят для аффинной очистки синтезируемого белка. .
7.Редкие кодоныв составе чужеродного гена, приводящие к снижению скорости его трансляции. Только аминокислота триптофан кодируется всего одним кодоном (UGG), остальные аминокислоты, из которых состоят белки, – по крайней мере, двумя, чаще четырьмя,
Для каждого типа организмов существует своя предпочтительная частота использования кодонов (codon usage) и, соответственно.
26. Емкость таких фаговых векторов ограничена размерами головки фага и это позволяет клонировать ДНК достаточно большого размера и всегда можно предполагать max. размер такого фрагмента Фаговая частица в которую упаковывается фрагмент ДНК м. б. сконструирована в системе in vivo, in vitro. В составе фаговых векторов м. б. клонированы гены, ответственные за синтез продуктов токсических для клетки. На фаг они не воздействуют.
Первыми были векторы созданные на основе фага λ. Для клонирования с его использованием в геноме выделяют 2 области - существенные и несущественные для внутриклеточного развития фага.
Существенные – обладают связью с репликацией, с образованием белков, с лизисом клетки после внутриклеточного развития фага. Максимальный размер чужеродной ДНК, которая м. б. клонирована в составе фага λ = 22 тыс. пар оснований.
В зрелых вирионах фага Я ДНК находится в виде двухцепочечной линейной молекулы. На концах молекулы ДНК имеются взаимокомплементарные GC-обога- щенные одноцепочечные концы (обозначаются как cosR и cosL). Сразу после попадания в клетку фаговая ДНК цикли зуется по этим концам и функционирует в клетке в кольцевой форме. Район ковалентно зашитых casR и cosh называется cos-caumoM. Фаг Я является умеренным фагом, т. е. в зависимости от условий может развиваться в клетке либо по литическому, либо по лизогенному пути.
При литическом развитии происходит лизис клеток и образуются инфекционные фаговые частицы, при лизогенном молекула ДНК фага Я интегрируется в бактериальную хромосому. 
По своей структуре вектор на основе фага λ делятся на:
Векторы внедрения – в единственный сайт рестрикции клонируется чужеродная ДНК, в результате суммарный размер рекомбинантной ДНК превосходит исходный размер векторной молекулы.
Векторы замещения – используются 2 рестриктазы и 1 из фрагментов замещается чужеродной ДНК. В этом случае размер рекомбинантной ДНК незначительно превосходит или равен исходному размеру векторной молекулы.
Преимущества
Во-первых, векторы на основе ДНК фага лямбда обладают значительно большей емкостью, в них можно клонировать фрагменты ДНК длиной от 5 до 25 т.п.о.
Во-вторых, фаговые частицы, содержащие упакованную ДНК, способны проходить литический цикл развития внутри бактериальных клеток и, следовательно, образовывать стерильные пятна (бляшки) на газоне бактерий. Такие бляшки содержат в концентрированном виде как сами фаговые частицы с упакованными в них рекомбинантными молекулами ДНК, так и все продукты метаболизма зараженных бактериальных клеток, включая белки и ферменты, которые появляются в результате экспрессии клонированных бактериальных генов.
Разработка упаковочной системы фага λ, т. е. возможность конструирования рекомбинантной ДНК и фаговой частицы in vitro привела к разработке таких векторных молекул – космиды и фазмиды – это векторные молекулы, сочетающие в себе свойства фагов и плазмидных векторов.