Характеристика цитологических методов исследования
| Название | Цель | Принцип |
| Витальная микроскопия | ||
| Микроскопия фиксированных клеток | ||
| Цитофотометрия | ||
| Фракционное центрифугирование | ||
| Авторадиография | ||
| Культура клеток | ||
| Гибридизация соматических клеток | ||
| Электронная микроскопия |
Работа № 2.Изучить устройство светового микроскопа.
|
Работа № 3. Правила работы со световыми оптическими приборами.
1) Микроскоп следует правой рукой брать за штатив, а левой – поддерживать основание.
2) Установите микроскоп. Тубусодеожатель должен быть обращен к вам, а зеркало – напротив света.
3) Поставьте объектив малого увеличения в рабочее положение, если действие выполнено правильно, то вы услышите легкий щелчок.
4) Запомните: изучение любого объекта начинается с малого увеличения.
5) Смотрите в окуляр и вращайте зеркало до тех пор, пока поле зрения не будет освещено ярко и равномерно.
6) Опустите объектив малого увеличения (х8) над столиком на высоту примерно 0,5см с помощью макрометрического винта (винт нужно вращать на себя).
7) Положите на предметный столик микропрепарат покровным стеклом вверх так, чтобы объект находился в центре отверстия предметного столика.
8) Смотрите на микроскоп сбоку и опускайте тубус с помощью винта на расстояние приблизительно 2 мм от объектива до препарата.
9) Смотрите в окуляр и медленно поднимайте тубус (вращайте винт на себя) до тех пор, пока не увидите четкого изображения объекта.
10) Перейдите к рассматриванию объекта при большом увеличении. Вращая револьвер, установите объектив большого увеличения (х40) над предметным столиком; дождитесь легкого щелчка; найдите фокус, вращая винтом. Запомните: большое увеличение позволяет видеть глубину объекта, поэтому резко видны то одни, то другие структуры. Фокусное расстояние при большом увеличении составляет приблизительно 1 мм.
11) По окончании работы приведите микроскоп в нерабочее состояние: объективы переведите в нейтральное положение (они не должны смотреть в отверстие в предметном столике); тубус опустите вниз до предела.
3.1. Записать виды объективов и общее разрешение.
| Увеличение Объектива | Окуляр (кратность увеличения) | Объектив (кратность увеличения) | Разрешающая возможность |
| Малое | |||
| Большое | |||
| Иммерсионное |
3.2. Работа с постоянными препаратами.
Разобрать методику приготовления постоянных препаратов. Рассмотреть постоянные препараты биологических объектов (тотальные и срезы).
1) Рассмотреть постоянный препарат (например, препарат клеток печени аксолотля) с помощью микроскопа при ув. 7х8 и 7х40. Отработать навык перехода с микроскопии объекта при малом увеличении на микроскопию объекта при большом увеличении. Зарисовать, отметить все видимые элементы: ядро, границы между клетками, цитоплазму.
2) Иммерсионная микроскопия (ув.7х90) микропрепарата клеток печени аксолотля (демонстрация). Уяснить назначение и принцип иммерсионной микроскопии.
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
для студентов 1 курса педиатрического факультета к занятию № 1.1.2. по теме: «Биология клетки. Эукариоты и прокариоты. Цитохимия»
Цель занятия: Рассмотреть строение прокариот и эукариот. Изучить органоиды животной и растительной клетки. Познакомиться с некоторыми основными цитохимическими реакциями.
В итоге занятия студент должен знать: Основные различия между прокариотичес-кой и эукариотической клеткой, животной и растительной клетками, строение и функции органоидов эукариотической клетки и способы их выявления цитохимическими методами.
В итоге занятия студент должен уметь:Самостоятельно получить изображение на малом и большом увеличении, идентифицировать ядро, границы клеток, окрашенные органоиды и клеточные включения.
Вопросы для самоподготовки:
1. Химический состав клетки.
2. Что такое органоиды?
3. Какие структуры лежат в основе строения органоидов клетки?
4. Классификация органоидов.
5. Особенности строения прокариотической клетки.
6. Как и в виде чего расположена наследственная информация прокариот?
7. Какие органоиды имеются у эукариот?
8. Функции ядра, ядрышек.
9.Сходства и различия в строении животной и растительной клетки.
Литература для подготовки:
Основная: Учебник по биологии. Под ред. В.Н. Ярыгина, 2008, 1 т, c.38-51.
Рекомендуемая:
1. Учебник по биологии. Под ред. В.Н. Ярыгина, 1984, с. 17-26
2. Учебник по биологии А.А. Слюсарева, с. 14-27.
Практическая работа:
Работа № 1. Строение прокариотических клеток на примере бактерий (таблица). Изучить по таблице особенности строения прокариот и записать в тетрадь эти особенности.
Работа № 2. Общий план строения эукариотических клеток растений и животных.
а) клетки растений
Рассмотреть при малом и большом увеличении препарат клеток пленки лука, отметить различия в строении про- и эукариот. Зарисоватьи отметить ядро, клеточную стенку, цитоплазму, вакуоли.
б) клетки животных
Рассмотреть постоянный препарат «срез печени аксолотля» при малом и большом увеличении, зарисовать, отметить все видимые элементы: ядро, границы между клетками, цитоплазму. Отметить в тетради различие в строении растительной и животной клетки.
Работа № 3. Изучение внутреннего строения эукариотической животной клетки.
Работа с электроннограммами. Рассмотреть строение плазматической мембраны, лизосом, ядра, митохондрий, комплекса Гольджи, эндоплазматической сети, клеточного центра, рибосом.
Работа № 4. Выявление ДНК в ядрах клетки по Фельгену.
Под иммерсионным увеличением микроскопа рассмотреть (демонстрация) микропрепараты клеток, окрашенные реактивом Шиффа, фуксин-сернистой кислотой по Фельгену. Зарисовать одну клетку. Отметить, что ДНК в ядре клеток окрашивается по Фельгену в сиренево-фиолетовый цвет. Обратить внимание на глыбчато-нитчатую структуру хроматина в ядрах клеток.
Работа № 5.Выявление РНК по Браше.
Рассмотреть при иммерсионном увеличении микроскопа (демонстрация) микропрепараты, окрашенные на РНК по Браше, полученные из печени крыс. Зарисовать одну клетку с реакцией на РНК. Указать, что РНК по Браше выявляется в виде гранул и глыбок и окрашивается пиронином в малиново-красный цвет. Одновременно метод Браше позволяет компонентам красителя – метиловым-зеленым окрашивать ДНК в зеленый цвет.
Работа № 6. Выявление гликогена.
Рассмотреть на большом увеличении микроскопа микропрепараты, окрашенные на гликоген Шик реакцией, полученные из печени крыс. Зарисоватьи указать, что гликоген окрашивается в темно-вишневый цвет реакцией с Шифф-йодной кислотой (смесь реактива Шиффа с йодной кислотой). ШИК-реакция и выявляется в виде гранул и глыбок, которые часто смещаются при фиксации ткани к одному из полюсов клетки.
Работа № 7. Выявление липидов в клетках.
Изучить на большом увеличении микроскопа микропрепараты, окрашенные на липиды осмиевой кислотой. Зарисовать одну клетку, указать, что нейтральные липиды выявляются в клетках при фиксации тканей осмиевой кислотой в виде мелких и крупных капель черного цвета.
Отметить, что липиды выявляются также веществами, растворимыми в них, например, судановыми красителями (судан черный, судан красный). Это органические красители, имеющие сложный состав.
Работа № 8. Выявление комплекса Гольджи.
Рассмотреть клетки, в которых комплекс Гольджи имеет черную окраску (импрегнация солями серебра или осмиевой кислотой). Он располагается обычно около ядра или вокруг клеточного центра, однако его локализация может изменяться в связи с функциональной активностью клетки. Зарисовать одну клетку и отметить локализацию комплекса Гольджи.
Работа № 9.Выявление митохондрий.
Рассмотреть под микроскопом митохондрии (окраска по Альтману). Они имеют вид красных гранул, палочек, колбочек. Зарисовать одну клетку с митохондриями.
Записать в тетради: Качественные реакции на различные компоненты клетки.
| Выявляемые компоненты клетки | Цитохимическая реакция | Характер выявления |
| ДНК в ядрах | Фельгена (реактив Шиффа – фуксин-сернистая кислота) | сиренево-фиолетовые глыбки в ядре |
| РНК | Браше (метиленовый зеленый – пиронин) | малиново-красные гранулы в цитоплазме и окрашенные ядрышки |
| Гликоген | Шик-реакция (Шифф-йодной кислотой) | Темно-вишневые глыбки в цитоплазме |
| Липиды | Осмиевая кислота | Включения в виде капель черного цвета |
| Комплекс Гольджи | Осмиевая кислота | Черные гранулы, извитые нити |
| Митохондрии | По Альтману (гематоксилин и кислый фуксин) | Гранулы, палочки красного цвета |
| Клеточный центр | Железный гематоксилин | 2 черные центриоли и ахроматиновые нити |
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
для студентов 1 курса педиатрического факультета к занятию № 1.1.3. по теме: «Организация генетического материала»
Цель занятия: Увидеть видоспецифичность кариотипов различных позвоночных и научиться идентифицировать хромосомы человека. Научиться анализировать кариотип человека, используя метод дифференциального окрашивания, по которому можно идентифицировать каждую хромосому.
В итоге занятия студент должен знать:Строение и принципы классификации хромосом. Понятие о кариотипе.
В итоге занятия студент должен уметь:Идентифицировать хромосомы по кариограммам и атласам, содержащим Парижскую номенклатуру хромосом.
Вопросы для самоподготовки:
1. Организация клеточного ядра. Роль ядра в обеспечении жизненных процессов в эукариотических клетках.
2. Особенности молекулярной структуры ДНК, особенности репликации ДНК.
3. Строение и функция хромосом. Правила хромосом.
4. Почему при микроскопии исследователь видит Х-образные хромосомы?
5. Чем отличаются гетеро- и эухроматиновые участки хромосом?
6. Принцип классификации хромосом. (Денверская и Парижская классификации, их отличия, преимущество Парижской классификации).
7. Кариотип – индивидуальный признак вида. Идиограмма.
Литература для подготовки:
Основная: Учебник по биологии. Под ред. В.Н. Ярыгина, 2008, 1 т, c. 117-148.
Рекомендуемая:
1. Учебник по биологии. Под ред. В.Н. Ярыгина, 1984, с. 35-47
2. Учебник по биологии А.А. Слюсарева, с. 27-33, с. 117-118.
Практическая работа:
Работа № 1.Хромосомный уровень организации наследственного материала.
1.1.Строение хромосом.
Пользуясь микропрепаратами и таблицами, рассмотреть строение хромосомы. Зарисовать и обозначить ее компоненты (центромера, плечи (короткое – p, длинное – q), хроматиду).
| |
| |
| |
| |
|
1.2. Хромосомный набор человека.
Рассмотреть под иммерсионным увеличением метафазную пластину из культуры лейкоцитов крови человека, подсчитать общее число хромосом, отметить их тип. Зарисовать 3 типа хромосом: мета-, субмета-, акроцентрическую, обозначить плечи хромосом и центромеру.
Основные типы хромосом человека (зарисуйте и отметьте положение центромеры):
–
–
–
1.3. Кариотипы различных животных и растений.
Рассмотреть фотографии с хромосомным набором макака-резус, крысы, лосося, мухи дрозофилы, определить число и структуру. Сделать записи об особенностях кариотипа в отличие от кариотипа человека.
Вывод:запишите вывод о видоспецифичности хромосом различных организмов.
Работа № 2. Идентификация хромосом человека согласно Денверской классификации.
Пользуясь раздаточным материалом – таблицами со стандартным кариотипом человека, измерить с помощью линейки короткое и общую длину хромосом кариотипа, принимая во внимание, что длина первой хромосомы равна 10 мкм, а рисунок кариотипа сделана таким образом, что первая пара хромосом равна 20 мм. Следовательно, для перевода длины хромосом в мкм необходимо полученные величины по измерению хромосом на фотографиях в мм уменьшить в 2 раза (2мм – 1мкм).
У хромосом высчитывается абсолютная длина – в мкм и центромерный индекс – отношение короткого плеча к длине всей хромосомы, выраженная в процентах. Затем с плаката или прилагаемой таблицы перевести все стандартные параметры всех хромосом человека. В конце работы следует отметить, что по данным параметрам (абсолютная длина и центромерный индекс) возможно идентифицировать все хромосомы кариотипа человека. Кроме того, в тетрадях необходимо записать таблицу, где следует отметить число крупных, средних и мелких акро-, субмета-, и метацентрических хромосом. Крупные 10-7,5 мкм, средние 7-4 мкм, мелкие 3,9-2 мкм.
| Акроцентрические ЦИ=19-30 | Субметацентрические ЦИ=31-39 | Метацентрические ЦИ=40-48 | |
| Крупные 10-7,5мкм | |||
| Средние 7-4мкм | |||
| Мелкие 3,9-2мкм |
Необходимо указать отличительные признаки набора мужских и женских хромосом.
ПАРАМЕТРЫ ХРОМОСОМ ЧЕЛОВЕКА
| Группа хромосом | A | B | C | D | Е | F | G | X | Y |
| № | 1-3 | 4, 5 | 6-12 | 13-15 | 16-17 | 19, 20 | 21, 22 | ||
| средн. | ср. | ср. | ср. | ср. | ср. | ср. | ср. | ср. | ср. |
| Абсолютная длина в мкм | |||||||||
| Длина короткого плеча (p) | |||||||||
| Центромерный индекс (α) |
Короткие плечи хромосом (р) 13,14,15 = 0,8 мкм; 21,22 = 0,6 мкм; Y = 0,5 мкм.
Работа № 3. Идентификация хромосом человека по Парижской системе классификаций.
Посмотреть метафазную пластинку дифференциально окрашенных хромосом человека (демонстрация). Проанализировать дифференциально окрашенный хромосомный набор человека на фотографии.
Зарисовать в тетради первую хромосому кариотипа человека, отметить гетеро- и эухроматиновые участки. Отметить и записать преимущества Парижской классификации перед Денверской классификацией.
Работа № 4. Политенные хромосомы.
Рассмотреть при большом увеличении микроскопа препарат слюнных желез личинок комаров и отметить их исчерченность. Зарисовать: на рисунке обозначить светлые зоны – эухроматиновые, интенсивно окрашенные зоны – гетерохроматиновые и пуфы-вздутия. Отметить и записать их функциональную значимость.
Вопросы к коллоквиуму