Молекулярно-генетические механизмы первичной детерминации пола у млекопитающих

2: Пол – совокупность морфологических и физиологических особенностей организма, обеспечивающих половое размножение, сущность которого сводится к оплодотворению, то есть слиянию мужских и женских половых клеток (гамет) в зиготу, из которой развивается новый организм.

3: дифференциация пола (фенотипический пол), то есть появление внешних гениталиев, вторичных половых признаков

первичное определение пола: появление гонады (репродуктивного органа соматической природы) самки или самца – яичника или тестиса

4: Считается, что принципиальная схема этого процесса консервативна.

Существует конкретный контролирующий сигнал, включающий некий ключевой ген. Этот ген, в свою очередь, активирует некое количество детерминант гонадогенеза и далее факторов дифференцировки половых признаков. Все компоненты этой системы могут различаться у разных животных. В табл. 1 предсталены принципиальные схемы определения пола у пекарских дрожжей, нематоды, дрозофилы, аллигатора и млекопитающих.

5: Детерминация пола у млекопитающих

Классическими эмбриогенетическими исследованиями установлены два правила определения пола у млекопитающих.

1)было сформулировано в 60-х годах Альфредом Жостом на основе экспериментов по удалению зачатка будущих гонад (гонадный валик) у ранних эмбрионов кроликов: приводило к развитию всех эмбрионов как самок. Было высказано предположение о секретировании гонадами самцов (тестисами) эффектора (тестостерона), ответственного за маскулинизацию плодов, и предсказано наличие второго эффектора антимюллеровского гормона (MIS, (Mullerian-inhibiting substance)), непосредственно контролирующего такие анатомические преобразования. Результаты наблюдений были сформулированы в виде правила: “Специализация развивающихся гонад в тестис или яичник определяет последующую половую дифференциацию эмбриона”.

Примерно до 1959 года предполагалось, что число Х-хромосом является важнейшим фактором контроля пола у млекопитающих. Однако обнаружение индивидуумов с единственной Х- хромосомой, развивающихся как самки, а особей с одной Y-хромосомой и множественными Х-хромосомами как самцы заставило отказаться от таких представлений. Сформулировано второе правило определения пола у млекопитающих: “Y-хромосома несет генетическую информацию, требуемую для детерминации пола у самцов”.

6: Комбинация приведенных выше двух правил иногда называется принципом Жоста: “Хромосомный пол, связанный с присутствием или отсутствием Y-хромосомы, определяет дифференциацию эмбриональной гонады, которая, в свою очередь, контролирует фенотипический пол организма”. Подобный механизм определения пола называют генетическим (GSD) и противопоставляют таковому, основанному на контролирующей роли факторов внешней среды (ESD) или соотношению половых хромосом и аутосом (CSD).

7: Биологической основой генетического механизма определения пола является бисексуальность эмбриональных гонад млекопитающих. В таких прогонадах одновременно присутствуют Мюллеровы (у самок) и Вольфовы (у самцов) протоки . Первичная детерминация пола начинается с появления в прогонадах специализированных клеточных линий – клеток Сертоли. В последних синтезируется предсказанный А. Жостом MIS(Mullerian-inhibiting substance), ответственный за прямое или опосредованное ингибирование развития Мюллерова протока – зачатка будущих фаллопиевых труб и матки.

Рис. 1. Развитие гонад у млекопитающих:

а – плод с недифференцированной прогонадой;

б – схема мочеполовой системы самцов и самок у такого плода. Гонадный бугорок развивается вместе с мезонефросом (почка). Прогонада морфологически неразличима. Первые половые различия между развивающими гонадами наблюдаются у человека через 6 недель после зачатия, у мышей на 12,5-й день. Мюллеров проток прогонады является предшественником матки, яйцеводов, верхней части влагалища, Вольфов проток –семяпроводящих протоков, семенных пузырьков.

8: Используя химерные клеточные линии мышей, удалось показать, что для нормального функционирования клеток Сертоли необходим XY-кариотип. Установлено также, что именно в этих клетках Y-хромосома деконденсирована и, может быть, транскрипционно активна. На рисунке показана схематически роль Y-хромосомы, сцепленного с ней гипотетического тестисопределяющего фактора (TDF) в развитии недифференцированной бисексуальной гонады в направлении тестисов и ингибировании появления яичников.

Рис. 2. Схема определения пола у млекопитающих: а – определение тестисов из четырех клеточных типов прогонады; б – временная диаграмма последовательных стадий определения пола. 1 – догонадная. Отсутствие у эмбриона половых органов; 2 – прогонадная. Появление гонадного валика и бисексуальной прогонады; 3 – формирование “гонадного пола” (первичное определение пола). Синтез TDF. Появление клеток Сертоли (из поддерживающих), окружающих половые клетки (семявыносящие канальцы); 4 – дифференциация пола. Синтез MIS (Mullerian-inhibiting substance) клетками Сертоли. Появление клеток Лейдига (из стероидогенных), продуцирующих андрогены. Маскулинизация внешних гениталиев.

9: Тестисопределяющие гены

Возможность построения и использования гене- тических карт животных, в частности Y-хромосомы человека и мыши, обеспечила установление гипоте- тического TDF(Testis determining factor). На рис. 3 представлена эволюция результатов “охоты” за этим геном применительно к конкретному интервалу на Y-хромосоме Homo sapiens.

Рис. 3. Поиск тестисопределяющего фактора (TDF)на Y-хромосоме человека:

1959 – вся Y-хромосома рассматривается как полопределяющая (2–3% гаплоидного генома);

1966 – гипотетический TDF связывают с коротким плечом;

1986 – поиск сужается до района 1 короткого плеча;

1987 – дальнейшее ограничение поиска участком 1А1 и приграничных участков. Выявлен ген ZFY(Zinc Finger Protein, Y-Linked);

1989 – обнаружены мужчины, не обладающие ZFY;

1990 – идентифицирован вероятный TDF – ген SRY(sex-determining region Y). Мутации, связанные с инверсией пола, захватывают лишь не- большой консервативный мотив этого гена HMG-бокс (High-Mobility Group )(80 аминокислотных остатков, 320 п.н.)

Его идентификация состоялась также благодаря анализу довольно редко встречающихся особей с хромосомной инверсией пола – самцов XX и самок XY. Подобного рода нарушения описаны для 17 видов млекопитающих и согласно основному принципу определения пола в этой систематической группе должны нести соответственно транслокацию или делецию Y-хромосомного фрагмента с TDF. У мышей описаны два типа самцов: XX-XXSxr и XXSxr'. Их появление обусловлено дупликацией и переносом несколько различающихся по размеру участков короткого плеча Y-хромосомы на общий для обеих гоносом (половых хромосом) так называемый псевдоаутосомальный (PAR) терминальный район Х-хромосомы. Такие самцы обладают тестисами, но их репродуктивная система дефектна из-за аномалий сперматогенеза. У них нет антигена гистосовместимости (HY-антиген), первоначально рассматриваемого как необходимый атрибут гетерогаметного пола и возможный TDF. Мужчины с кариотипом XX, обладающие нормальными тестисами, но стерильные, встречаются у человека с частотой 1 : 20 000.

10: В 1987 году Дэвид Пэйдж и его коллеги, исследуя мужчину XX, унаследовавшего 280 т.п.н. фрагмент Y-хромосомспецифической ДНК, и женщину XY с делецией (нехваткой), захватывающей эту область в результате обмена участками между хромосомами Х и 22, казалось, обнаружили ускользающий TDF ­– присутствующий в Y-хромосоме всех настоящих зверей Eutheria ген ZFY. Гомолог ZFY ZFX обнаружен в Х-хромосоме, причем он избегает характерной для генов, в ней локализованных, инактивации. Оба эти фактора кодируют белок, образующий структуру так называемых цинковых пальцев, обладающий ДНК-связывающей активно-стью, который можно рассматривать как фактор транскрипции. Но: у млекопитающих для детерминации гонад не требуется присутствия половых клеток, но это оказалось необходимым для активности одного из двух мышиных гомологов ZFY-zfy1 гена. Весомым контраргументом против рассмотрения ZFY в качестве TDF явилось его аутосомное местоположение у сумчатых (подкласс Metatheria, низшие звери), для которых, как и Eutheria (у высших зверей), характерно участие Y-хромосомы в определении пола. В последнее время появились данные, от- рицающие прямую зависимость между наличием половых клеток и экспрессией zfy1 гена. Однако даже эта поправка оставляет для ZFY-подобных генов только важную роль в последующей половой дифференциации, а не первичной детерминации пола.

11: Следующий кандидат – ген получил название SRY (Sex determining Region Y gene). +:

· SRY расположен в полопределяющей области и содержит консервативный домен (HMG-бокс), кодирующий белок размером 80 аминокислотных остатков;

· его активность отмечена накануне периода дифференциации прогонады в тестис – на этой стадии не зависит от присутствия половых клеток;

· специфические точковые мутации или делеции в HMG-боксе этого гена у женщин XY приводят к инверсии пола;

· перенос 14 т.п.н. фрагмента ДНК, содержащего этот ген с фланкирующими участками, в оплодотворенную яйцеклетку гомогаметной особи с помощью микроинъекции (переноса генов) привел к появлению “самца” с XX-кариотипом. Правда, у этого животного отмечен дефектный сперматогенез;

· белок, кодируемый HMG-боксом SRY-гена, специфически связывается с ДНК, приводя к изгибанию ее молекулы. Такая деформация может механически передаваться на расстояние и играть важную роль в регуляции транскрипции, репликации и рекомбинации;

· имеется экспериментальный материал, свидетельствующий в пользу опосредованного положительного контроля SRY-активности со стороны белкового продукта MIS-гена и отрицательного гена ароматазы, контролирующего превращение мужских стероидных гормонов в женские.

Только HMG-бокс является консервативной частью гена SRY. Способность связываться с ДНК, а также специфическая локализация белкового продукта в ядре также определяются этим доменом. За пределами этой последовательности наблюдается существенное различие между гомологами SRY даже у близких видов.

SRY – один из членов большого семейства генов (более 20 членов), получившего название SOX (SRY type HMG box). Для этого семейства характерна тканеспецифическая экспрессия в раннем эмбриогенезе. Sox1, Sox2 и Х-хромосомный Sox3 активны при развитии нервной системы. Sox4 работает как активатор транскрипции в Т-лимфоцитах, а Sox5 проявляет специфическую активность во время сперматогенеза. Недавно изолирован человеческий гомолог Sox9 гена мыши, требующийся для нормального развития скелета и ответственный за CD- синдром (campomelic displasia).

12: Гены, участвующие в детерминации пола

В последнее время было обнаружено, что эмбрионы и гонады будущих самцов растут быстрее и такие отличия наблюдаются у человека, мышей и крыс еще до появления первых клеток Сертоли и даже гонадного бугорка. Высказано предположение о том, что клетки прогонад должны подвергнуться определенному числу делений для дифференциации клеток Сертоли. Гиопотетический ген: Gdy (growth and development), расположенный в Sxr-участке Y-хромосомы мышей.

Описан ген WT1(Wilms tumor) у человека, вызывающий ряд наследственных заболеваний: опухоль Вильмса, синдром Дэнис–Драма, экспрессирующийся на 9-й день эмбрионального развития и контролирующий развитие недифференцированной, бисексуальной гонады.

13: ген Sox9(SRY type HMG box), локализованный на хромосоме 11 мыши и имеющий гомолог на хромосоме 17 человека, помимо доминантного CD- синдрома – смертельного нарушения развития костей, играет роль в аутосомальной инверсии пола. Исходя из ранней экспрессии этого гена до 13-го дня эмбрионального развития в зародышевой соединительной ткани, его рассматривают как модификатор влияния SRY на экспрессию MIS (Mullerian-inhibiting substance), своеобразный ограничитель рамок его активности в раннем эмбриогенезе.

Исследование более 100 случаев XX индивидуумов, являющихся фенотипическими мужчинами, но не обнаруживающих присутствия гена SRY, заставило предположить существование рецессивного гена Z. Продукт этого гена является отрицательным регулятором развития тестисов: в норме функционирует у самок, а у самцов его активность блокируется геном SRY. Предполагается и существование аллели Zi , нечувствительной к такому подавлению (супрессии).

14: ген DAX1, локализованный на участке Xp21. При дупликации он вызывает зависимую от дозы реверсию мужского пола к женскому. Предполагается, что DAX1 чувствителен к гормонам и в увеличенной дозе способен преодолеть сигнал SRY и сдвигать развитие гонад в направлении яичника. Этот ген рассматривается как реликт более примитивной Х- хромосомной системы детерминации пола.

Стероидогенный фактор SF1, экспрессия которого отмечена в недифференцированной прогонаде у мышей. Мутации по SF1-гену могут приводить к отсутствию гонад у обоих полов. Предполагается и его участие в контроле активности гена антимюллеровского гормона (MIS) в клетках Сертоли.

15: Аутосомный ген Tda1b(testis-determining autosomal), взаимодействующий с TDF(Testis determining factor), объясняют появление овотестиса или яичника у мышей с кариотипом XY. В присутствии трансгена, содержащего аллель гена SRY, у таких гибридов развиваются исключительно тестисы. Экспрессия же других генов, связанных с появлением тестисов (MIS, P450-ароматаза, 17(α)-гидролаза), задержана в овотестисах или отсутствует в яичниках. Это результат каких-либо нарушений экспрессии генов, участвующих в определении пола на более поздних этапах, чем Sry, например Tda1b.

Аутосомный ген Tas (Testis associated sex reversal gene), у мышей расположенная в хромосоме 17, приводит к появлению XY-самок и гермафродитов с овотестисами.

У других видов:

16: Клонирован и локализован в участке Xq11-12 ген рецептора андрогенов человека AR, ответственный за тестикулярную феминизацию (мутация Tfm), известную для ряда объектов.

Изучение наследования XY-синдрома реверсии пола у лошадей показало, что в такой передаче участвуют по крайней мере два гена: основной полопределяющий и ген (или гены)- модификатор.

17: У самцов американских коккер-спаниелей с XX-кариотипом также предлагается аутосомный ген – детерминатор инверсии пола.

Описана аутосомная мутация Polled, приводящая у коз к появлению тестикулярных тканей у особей с XX-кариотипом.

18: В настоящее время доказано, что активность TDF-SRY является недостаточным условием появления семенников из потенциально бисексуальных прогонад у млекопитающих.

Дополнительных генетические факторы контроля первичной детерминации пола и их взаимодействии дает табл. 2.

19: Y-хромосома и пол

Для У -хромосомы характерны специфические черты, резко отличающие ее от других хромосом набора:

1) обедненность генами;

2) обогащенность повторяющимися блоками нт, и в частности многократно тандемно повторяющими (сателлитной ДНК);

3) присутствие значительных гетерохроматиновых районов;

4) наличие области гомологии с Х- хромосомой – псевдоаутосомальной области (PAR).

20: Y-хромосома, как правило, невелика – 2–3% гаплоидного генома. Однако кодирует нескольких тысяч генов.

Обращает на себя внимание и тот факт, что большая часть генов этой хромосомы имеет X-хромосомные аналоги. Это касается и генов, непосредственно вовлекаемых в определение пола: ZFX / ZFY, SOX3 / SRY, UBE1X / UBE1Y, SMCX/SMCY.

Схема эволюции генов Y-хромосомы представлена на рис. . Схема определения эволюции генов Y- хромосомы в связи с определением и дифферен- циацией пола. Гены Sox3 и UBE1 принадлежали к консервативной части прогоносомы, ZNF – к более новой ее части. На постепенно деградирующей Y-хромосоме аллель Sox3 /SRY приобретает тестисопределяющие функции, а аллели UBE1/UBE1Y и ZNF/ZNY – роль в сперматогенезе. Другие X-хромосомные гены на Y-хромосоме исчезли в результате мутаций, делеций и т.д. Ген UBE1Y утерян у приматов, возможно, за счет выполнения его функций другими генами (SMCY, YRRM и т.д.) реализуется функция детерминации пола.

Генетическая значимость У-хромосомы связана с преемственностью между поколениями, в частности с контролем гаметогенеза, первичной детерминацией пола.

Первоначально Y-хромосома, очевидно, контролировала “гаметный пол” – гаметогенез и не была связана с первичным определением пола, и только у позвоночных к ней приходит эта функция. Ее влияние особенно сильно у млекопитающих. В частности, предполагается, что такая специфическая Y-хромосомная система появилась специально для обеспечения развития эмбрионов обоих полов в “море материнских эстрогенов” – женских половых гормонов. Прогонады у этих объектов успевают сделать выбор в пользу тестисов с помощью специального генетического блокирующего механизма еще до воздействия женских гормонов.

21: общая схема

Гонады самцов растут быстрее, что контролируется геном Gdy (growth and development), который расположен на Y-хромосомы мышей.

Можно выделить три основных этапа детерминации пола у высших (плацентарных) млекопитающих: 1) закладка индифферентной гонады;

Первый этап связан с активностью генов WT1 (Wilmstumor 1) и SF1 (steroidogenic factor 1). Ген WT1, находящийся у человека на 11-ой хромосоме, отвечает за возникновение одной из форм детского рака, его нуль-мутация приводит к полному недоразвитию почек и гонад. SF1 кодирует орфан, ключевой регулятор ферментов, участвующих в образовании половых гормонов. При его нуль-мутации развитие гонад нарушается и они дегенерируют. Позднее его экспрессия продолжается в зачатке семенника. Одной из его мишеней является ген антимюллеровского фактора.

2) детерминация пола гонады и ее первичная дифференцировка; 3) гормонзависимая фаза дифференцировки пола.

Второй этап – детерминация пола гонады – обусловлен активностью генов SRY (sex determining region of the Y) и DAX1 (DSS-AHC critical region of the X). Одним из генов, который находится под контролем SRY, является ген Sox-9 (SRY-box related 9), он экспрессируется в клетках полового гребня после SRY. При мутациях по этому геному нарушается нормальное развитие скелета и происходит реверсия пола. Кроме этого, обнаружены гены аутосом, находящиеся под контролем гена SRY. Например, гены Tda (testis determining autosomal gene) и Tas (Testis associated sex reversal gene) являются необходимы для правильного развития семенников, при их мутациях может происходить реверсия пола.

Для правильного образования яичников тоже необходимо участие различных генов. Важную роль в детерминации женского пола у млекопитающих играет расположенный в коротком плече Х-хромосомы локус DSS (dosage sensitive sex reversal). Избыточное количество белка DAX1 (при дупликации этого района) подавляет действие белка SRY и ведет к формированию женских особей с генотипом XY. Было выявлено, что белок DAX1 относится к семейству ядерных рецепторов гормонов. На ранних этапах развития он экспрессируется в клетках полового гребня у зародышей обоих полов. Позднее, когда начинается экспрессироваться SRY, его экспрессия прекращается, но продолжается у зародышей женского фенотипа. Критическое значение для развития яичника играет также аутосомный ген Wnt4a. Вероятно, он подавляет экспрессию тестостерона и антимюллеровского гормона, так как при его мутациях эти гормоны экспрессируются, что приводит к формированию мужского фенотипа.

22: Разнообразие механизмов определения пола

У млекопитающих реально существуют варианты определения пола без участия SRY-гена или Y-хромосомы. Хромосомная инверсия пола в норме встречается у многих видов (Myopus schisticolor Лесной леммин и др.) за счет генов-модификаторов Х-хромосомного, Y-хромосомного или аутосомного происхождения. Описаны даже фертильные кобылы с ХY-кариотипом. Для сумчатых характерна дифференциация мошонки, молочных желез, направляющей связки тестисов, влагалищного отростка еще до появления гонад. Развитие же Вольфова и Мюллерова протока, как и у всех высших зверей, находится под гормональным контролем. Для кенгуру отмечено практическое отсутствие X–Y-хромосомного спаривания, рекомбинация может быть ограничена только очень небольшой областью гомологии. ZW/ZZ-система определения пола у птиц аналогична XX/XY-хромосомному варианту млекопитающих. Гонадный пол у птиц можно переделать с помощью инъекции ингибитора ароматазы, что невозможно у млекопитающих несмотря на сходство метаболизма стероидов. Описаны виды рыб с хорошо дифференцированными половыми хромосомами, обладающие способностью преодоления генетического механизма гонадогенеза при помощи факторов внешней среды. Примеры разнообразных вариантов системы определения пола различны. На рисунке представлены вариации детерминации пола у различных животных.

Возможные пути генетического контроля гонадогенеза у позвоночных:

а – предполагается наличие некоторого сходного многоэтапного механизма гонадогенеза и разнообразие генетического контроля этого процесса в разных группах позвоночных.

(этап гонадогенеза, положительный контроль, отрицательный контроль)

б – гипотетический механизм температурного варианта определения пола. Этапы, взятые в рамки, предполагают температурочувствительность. LH и LHRH – люитенизирующий гормон и его релизинг – агент, положительно контролирую- щий синтез LH.

В настоящее время поняты лишь некоторые узловые элементы такой системы.