Методы клинико-диагностических микробио­логических исследований

• Методы обнаружения возбудителя в материале от больного

Для обнаружения возбудителя в материале от больного с диагностической целью применяют:

1) микроскопические (бактериоскопические, микоскопичес-кие, вирусоскопические) методы;

2) микробиологические (бактериологические, микологичес­кие, вирусологические) методы;

3) биологические методы, или биопробы.

1. Микроскопические методы.Микроскопические методы применяют для обнаружения возбудителей (бактерий, грибов, простейших, вирусов) непосредственно в исследуемом мате­риале.

Для выявления бактерий (бактериоскопические ис­следования), а также грибов и простейших применяют све­товые методы микроскопии окрашенных или нативных пре­паратов, приготовленных из материала, полученного от боль­ного (см. тему 1.1 иглаву 2).

Преимущество микроскопических исследований состоит в быстроте (осуществление требует не более 30—60 мин), про­стоте и дешевизне. Основным недостатком метода является низкая специфичность — невозможность видовой идентифика­ции обнаруженных микроорганизмов, а в ряде случаев — их дифференциации между собой (например, эшерихий, сальмо­нелл и шигелл). Чувствительность также невысока: микроско­пический метод позволяет обнаружить возбудителя при его концентрации не менее 10^б микробных клеток в 1 мл или 1 г исследуемого материала.

В большинстве случаев микроскопический метод имеет ори­ентировочное значение и позволяет получить предварительные данные о микробах, присутствующих в материале, и наметить пути дальнейших исследований. Вместе с тем при некоторых бактериальных инфекциях, а также при микозах и протозой-

ных инфекциях диагностическая ценность микроскопического исследования весьма велика и является основанием для поста­новки окончательного диагноза заболевания, например воз­вратного тифа, гонореи, дерматомикозов и др.

Необходимо помнить, что некоторые бактерии (хламидии, микоплазмы) имеют малые размеры, лежащие за пределами разрешающей способности световой микроскопии, и не могут быть выявлены с помощью этих методов.

Вирусоскопические исследования осуществляют с использованием электронной микроскопии (по причине малых размеров вирусов, см. тему 5.1). В сочетании с компьютерными системами анализа изображений эти методы позволяют осу­ществлять предварительную идентификацию вирусов по мор­фологии. К числу достоинств метода относится также возмож­ность обнаружения ранее неизвестных вирусов. Чувствитель­ность метода аналогична бактериоскопическому.

Для диагностики инфекций, вызванных облигатными внут­риклеточными паразитами, применяют также цитологичес­кие методы, направленные на выявление характерного ЦПД в зараженных клетках, например внутриклеточных включе­ний — телец Бабеша—Негри при бешенстве, телец Пашена и Гварниери при оспе или цитомегалических клеток при заболе­ваниях, вызванных цитомегаловирусом (см. тему 5.2).

2. Микробиологические методы.Основаны на выделении чистой культуры возбудителя из материала, полученного от больного, и ее последующей идентификации (см. главу 3). Микробиологические методы отличаются высокой чувстви­тельностью и специфичностью. Располагая чистой культурой возбудителя, можно определить его родовую ивидовую при­надлежность иосуществить внутривидовое типирование, обна­ружить факторы вирулентности, а также определить чувстви­тельность к антибиотикам, что необходимо для рационального выбора этиотропной терапии.

Для эпидемиологического анализа вспышек инфекционных заболеваний проводят типирование культур возбудителей, вы­деленных от разных больных и из внешних объектов — веро­ятных источников заражения (вода, пищевые продукты ит.д.), т.е. определение их биовара: серовара (серотипирование, см. тему 10.1), фаговара (фаготипирование, см. тему 5.3) ит.д. Кроме того, микробиологические исследования проводят для выявления носительства патогенных микробов среди детей и взрослых, а также среди работников медицинских учреждений, предприятий пищевой промышленности и общественного пи­тания.

Бактериологическое исследование является ведущим в диагностике большинства бактериальных инфекций. Труд­ности метода могут быть связаны с низкой скоростью размно­жения бактерий-возбудителей, сложными ростовыми потреб-

ностями и требовательностью к условиям культивирования (га­зовому составу атмосферы и т.д.)- Однако только выделение чистой культуры возбудителя из материала от больного при исключении контаминации имеет абсолютное диагностическое

значение.

Микологические исследования осуществляют реже, чем бактериологические, поскольку микроскопическая диа­гностика микозов достаточно надежна. Микологические иссле­дования являются обязательными при диагностике кандидозов, а также глубоких микозов.

Вирусологический метод является наиболее достовер­ным для диагностики вирусных инфекций. Однако его приме­нение ограничивается трудоемкостью, что связано с особен­ностями хранения, транспортировки и обработки исследуемого материала, использованием культур клеток, сложностью и дли­тельностью культивирования многих вирусов, а также со срав­нительно частым получением отрицательных результатов. Идентификацию чистой культуры выделенного вируса осу­ществляют иммунологическими методами на основании его антигенной структуры, а также в ряде случаев спомощью биохимических и молекулярно-биологических методов (гибри­дизация НК, рестрикционный анализ и др., см. тему 3.2). Особое значение вирусологический метод приобретает в случае необходимости оценки чувствительности возбудителя к проти­вовирусным препаратам. В ряде случаев вирусологический ме­тод используют для ретроспективной диагностики вирусных

инфекций.

Все микробиологические методы имеют определяющее зна­чение в лабораторной диагностике инфекционных заболева­ний, являются наиболее информативными и достоверными. К числу недостатков можно отнести длительность (см. главу 3) и отсутствие методов культивирования некоторых микробов (например, возбудителей сифилиса и лепры).

3. Биологические методы (биопробы).Биопробу осуществля­ют путем заражения лабораторных животных материалом, по­лученным от больного. Этот метод применяют для выделения чистой культуры возбудителя в тех случаях, когда микроорга­низмы не растут или плохо культивируются, когда микробио­логические методы не дают однозначно положительного ре­зультата, а также для дифференциации патогенных микроор­ганизмов и определения их вирулентности. Дифференциация возбудителей основана на неодинаковой чувствительности раз­ных лабораторных животных к определенным микроорганиз­мам. В настоящее время биопробы применяют только в случае крайней необходимости, что определяется в первую очередь гуманным отношением к животным, а также связано с повы­шенным риском заражения персонала диагностической лабо­ратории.

• Иммунохимические методы диагностики: (методы обнару­жения антигенов возбудителя в материале от больного)

1. Метод иммунофлюоресценции (ИФ).Дает возможность
обнаружить в материале от больного антигены микроба с по­
мощью специфических антител, меченных флюорохромами
(см. тему 10.1). Этот метод позволяет выявлять и идентифици­
ровать по антигенной структуре возбудителей в материале,
содержащем разнообразную микрофлору (например, в испраж­
нениях), а также обнаруживать вирусные антигены в заражен­
ных клетках. В настоящее время иммунофлюоресцентный ме­
тод широко применяют для обнаружения разнообразных мик­
роорганизмов в патологическом материале.

2. Иммуноэлектронная микроскопия (ИЭМ).Позволяет зна­чительно повысить чувствительность и специфичность вирусо-скопического метода. Исследуемый материал, содержащий свободные вирусные частицы, обрабатывают специфическими антителами. Образовавшиеся иммунные комплексы осаждают высокоскоростным центрифугированием и агрегаты вирусных частиц выявляют с помощью электронной микроскопии. Су­ществуют также твердофазные методы ИЭМ: специфические антитела фиксируют на специальных сетках для ЭМ, которые затем обрабатывают исследуемым материалом. Вирусные час­тицы специфически связываются сантителами, после чего их выявляют с помощью электронной микроскопии. В ряде слу­чаев применяют антитела, меченные частицами золота (см. тему 10.1).

3. Другие серологические реакции.Растворимые антигены различных возбудителей (компоненты микробных клеток, ви-рионов, неструктурные вирусные белки, секретируемые зара­женными клетками, бактериальные экзотоксины и ферменты и т.д.) могут быть обнаружены в различных биологических жидкостях больного с помощью серологических реакций. Наи­более часто применяют иммуноферментный (ИФА) и радио­иммунный (РИА) анализ в связи с их высокой чувствительнос­тью, реже используют методы преципитации в геле и непрямой агглютинации (см. тему 10.1).