Микробиологическая диагностика инфекций ЦНС, вызванных прионами

Общепринятые методы лабораторной диагностики отсутст­вуют. Диагноз устанавливают преимущественно на основании клинической картины заболевания и подтверждают гистологи­ческим исследованием тканей пораженных участков головного мозга. Наблюдается дегенерация нейронов и аксонов серого вещества головного мозга, накопление амилоидоподобного ве­щества, образующего бляшки и фибриллярные скопления внутри и вне нейронов, гипертрофия глиальных клеток и дру­гие изменения, характерные для спонгилоформной энцефало­патии. В последние годы разработаны методы иммунохимичес-кого обнаружения аномальной формы приона (РгР^^с) в клетках головного мозга методом ИФ. Метод также позволяет проде­монстрировать накопление PrP^Sc в клетках роговицы глаза на ранних стадиях болезни.

• Диагностические, профилактические и лечебные препараты

Диагностические поливалентная и типоспецифические полио-миелитные сыворотки.Применяют для идентификации и типи-рования вирусов полиомиелита.

Диагностические поливалентные и типоспецифические (моно­валентные) сыворотки к вирусам Коксаки и ECHO.Применяют для идентификации и типирования соответствующих вирусов.

Пероральная живая вакцина против полиомиелита (трехва­лентная).Содержит ослабленные штаммы вирусов полиомие­лита I—III типов. Вакцина выпускается в жидком виде и в форме драже. Применяют для профилактики полиомиелита (создание активного иммунитета).

Парентеральная инактивированная вакцина против полиомие­лита (трехвалентная).Содержит инактивированные вирусы по­лиомиелита I—IIIтипов. Применяют для профилактики полио­миелита (создание активного иммунитета).

Диагностикум из вируса клещевого энцефалита.Используют для серодиагностики клещевого энцефалита.

Инактивированная культуральная вакцина против клещевого энцефалита.Стерильный специфический антиген вируса кле­щевого энцефалита, инактивированного формалином. Приме­няют для профилактики клещевого энцефалита по эпидеми­ческим показаниям (создание активного иммунитета).

Иммуноглобулин против клещевого энцефалита.Содержит противовирусные специфические антитела, получаемые из сы­воротки крови лошадей, гипериммунизированных вирусом клещевого энцефалита. Применяют для лечения и экстренной профилактики клещевого энцефалита (пассивный иммунитет).

Живая антирабическая вакцина Ферми.Изготавливают из мозга молодых овец, зараженных фиксированным (аттенуиро-ванный штамм) вирусом бешенства. Вирус в суспензии мозга обрабатывают 1 % раствором фенола и лиофилизируют. При­меняется для создания активного иммунитета с целью профи­лактики бешенства. Вакцину вводят лицам, укушенным подо­зрительными на бешенство животными. Поствакцинальный им­мунитет развивается через 2 нед и сохраняется в течение 6 мес.

Культуральная убитая антирабическая вакцина.Получают пу­тем химической инактивации вируса бешенства, выращенного в культуре клеток. Применяют для профилактики бешенства (создание активного иммунитета).

Антирабический иммуноглобулин.Получают путем гиперим­мунизации лошадей фиксированным вирусом бешенства. При­меняют для создания пассивного иммунитета с целью профилак­тики бешенства. Препарат вводят не позднее 72 ч после укуса животного в сочетании с антирабической вакциной. Препарат обезвреживает вирус бешенства и предупреждает развитие пост­вакцинальных энцефалитов.

жительный инкубационный период, а также способность к персистенции, что является причиной развития хронической инфекции. Обязательной мерой профилактики заражения ви­русным гепатитом при переливании крови является контроль доноров крови на носительство вирусов гепатита. Заболевания, протекающие с поражением печени — гепатитом — в качестве одного из проявлений генерализованной инфекции, способны вызывать также другие вирусы. Наиболее часто гепатит возни­кает при инфекциях, вызванных вирусом желтой лихорадки, герпесвирусами (CMV, HSV-l, HSV-2, EBV). Гепатит также может развиваться при тяжелых формах кори, паротита, крас­нухи, вирусных системных лихорадок. Лабораторная диагнос­тика этих инфекций описана в соответствующих главах.

Тема 20.1. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА КИШЕЧНЫХ ВИРУСНЫХ ИНФЕКЦИЙ И ВИРУСНЫХ ГЕПАТИТОВ

▲ План

▲ Программа

1. Биологические свойства возбудителей кишечных ви­русных инфекций и вирусных гепатитов, их патоген-ность, экология, особенности инфекции и эпидемио­логия вызываемых заболеваний.

2. Микробиологическая диагностика.

3. Диагностические, профилактические и лечебные пре­параты.

А Демонстрация

1. Реакция преципитации в агаре (встречная диффузия в геле по Оухтерлони) для обнаружения HBs-антигена в сыворотке крови больного вирусным гепатитом В.

2. Диагностические, профилактические и лечебные пре­параты.

▲ Задание студентам

1. Указать материал для исследования.

2. Учесть результаты выявления специфических HBs-ан-тигенов в сыворотке крови больного с помощью РИГА.

3. Учесть результаты выявления специфических HBs-ан-тигенов в сыворотке крови донора с помощью имму-ноферментного метода.

4. Учесть результаты выявления анти-НВз-антител в сы­воротке крови больного с помощью РИГА. Оценить нарастание титра анти-ИВв-антител в динамике забо­левания.

5. Учесть результаты выявления в сыворотке больного IgM против вируса гепатита А.

6. Дать краткую характеристику демонстрируемым диа­гностическим, профилактическим и лечебным пре­паратам.

▲ Методические указания

• Микробиологическая диагностика кишечных вирусных ин­фекций

МАТЕРИАЛ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ: испражнения.

МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ:

Вирусоскопическое исследование. Является одним из веду­щих методов диагностики кишечных вирусных инфекций. Зре­лые вирионы в испражнениях можно обнаружить с помощью метода электронной микроскопии.

Вирусологическое исследование. Применяют исключительно с целью диагностики эпидемий и вспышек кишечных вирус­ных инфекций. Для выделения реовирусов и ротавирусов из испражнений используют различные типы клеточных культур (HeLa, первичные культуры клеток почек обезьян и др.). Ин­дикацию осуществляют по ЦПД, которое развивается в течение 3 нед и характеризуется появлением внутрицитоплазматичес-ких включений и неспецифической дегенерацией клеток. Ве­дущим методом идентификации и типирования является ана­лиз фрагментов вирусной РНК методом электрофореза. Выде­ление чистой культуры вирусов ECHO — см. главу 9. Кишеч­ные коронавирусы, калицивирусы, астровирусы и аденовирусы не удается культивировать in vitro.

Экспресс-методы диагностики: иммунохимические и молеку-лярно-биологические исследования. Иммунохимические ис­следования. Присутствие антигенов вирусов в испражнениях можно определить с помощью метода ИЭМ (антигены цельных вирионов) и чувствительных серологических реакций (латекс-агглютинации, ИФА, РИФ и др.).

Молекулярно-биологические исследования. Вирус­ные НК в испражнениях можно обнаружить с помощью ПЦР или метода ДНК-зондов.

Серодиагностика. Серодиагностика при кишечных вирусных инфекциях малоинформативна и применяется преимуществен­но с целью ретроспективной диагностики и для оценки эпи­демиологической ситуации. Для определения противовирусных антител в крови пациента применяют различные серологичес­кие реакции (РИГА, ИФА, РИА и др.). Ретроспективную диа­гностику осуществляют методом парных сывороток. Диагнос­тическое значение имеет нарастание титра антител в поздней сыворотке не менее чем в 4 раза. Выявление (методом ИФА) специфических противовирусных иммуноглобулинов класса М (IgM) свидетельствует об активной инфекции.

• Микробиологическая диагностика вирусного гепатита А

МАТЕРИАЛ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ: кровь, испражнения. МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ:

Вирусоскопическое исследование. Зрелые вирионы в испраж­нениях можно обнаружить с помощью метода электронной микроскопии.

Экспресс-методы диагностики: иммунохимические и молеку-лярно-биологические исследования. Иммунохимические исследования. Присутствие антигенов вируса в испражне­ниях можно определить с помощью метода ИЭМ (антигены цельных вирионов) и чувствительных серологических реакций ИФА, РИА и др. В типичных случаях вирус гепатита А удается обнаружить в фекалиях за 10—14 дней до появления клини­ческих признаков заболевания. Вирус продолжает выделяться с испражнениями в течение 2—3 нед после начала желтухи.

Молекулярно-биологические исследования. Вирус­ные нуклеиновые кислоты в крови пациента на ранних сроках болезни обнаруживают с помощью ПЦР или метода ДНК-зон­дов.

Серодиагностика. Является ведущим методом диагностики вирусного гепатита А. Для определения противовирусных ан­тител в крови пациента применяют различные серологические реакции (РИГА, ИФА, РИА и др.). Серодиагностику осущест­вляют методом парных сывороток (диагностическое значение имеет нарастание титра антител в поздней сыворотке не менее чем в 4 раза) или на основании выявления (методом ИФА) специфических противовирусных иммуноглобулинов класса М (IgM), свидетельствующих об активной инфекции. Последние присутствуют в сыворотке крови с первых дней заболевания и исчезают не ранее чем через 3—4 мес.

Для выявления IgM против вируса гепатита А используют различные варианты ИФА. Противовирусные IgM можно вы­явить следующим способом: на первом этапе на стенках лунок пластиковых планшетов адсорбируют антитела против челове­ческих IgM, на втором этапе в лунки вносят испытуемую сыворотку в различных разведениях. Фиксированные анти-IgM-антитела связывают все IgM сыворотки, в том числе и противовирусные антитела. Далее вносят стандартный антиген вируса гепатита А и меченые антитела против этого антигена. После инкубации и тщательного промывания буферным рас­твором с детергентами в лунки добавляют субстрат и хромоген. В положительном случае через несколько минут наблюдается появление окраски.

• Микробиологическая диагностика вирусного гепатита В

МАТЕРИАЛ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ: кровь, биоптат печени.

МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ:

Экспресс-методы диагностики: иммунохимические и молеку­лярно-биологические исследования. Иммунохимические исследования. Присутствие вирусспецифических антигенов в крови можно определить с помощью различных серологических реакций: иммунопреципитации в геле, РНГА, ИФА, РИА и др. На разных стадиях заболевания и при разных формах инфекции (острой, хронической, вирусоносительстве) в крови присутствуют разные антигены вируса (HBs, НВё), что используют с целью диагностики (табл. 20.1.1). Через 3—5 нед после заражения виру­сом гепатита В и за 4—5 нед до появления клинической картины в сыворотке крови больных обнаруживают поверхностный анти­ген вируса — Я&-антиген (австралийский антиген). Выявление ЯДу-антигена свидетельствует о текущей острой или хроничес­кой инфекции и является основным методом контроля крови доноров. Присутствие ЯЯе-антигена является ведущим марке­ром активной репродукции вируса.

Таблица 20.1.1. Определение антигенов (Аг) и антител (Ат) в крови при лабораторной диагностике вирусного гепатита В

Период болезни	HBs	НВс	HBe
	Аг	Ат	Ат	Аг	At
Инкубационный период	+	—	—	+	—
Продромальный период	+	—	± (IgM)	+	—
Острый период	+	—	+ (IgM)	+	—
Реконвалесценция: ранняя	—	—	+	—	±
поздняя	—	+	+ (IgG)	—	+
Хроническая активная форма	+	±	+ (IgG)	+	±
Хроническая бессимптомная	+	—	_	—	±
форма (носительство)

Наиболее простой и специфичный, но низкочувствитель­ный метод обнаружения Я&-антигена — реакция встречной иммунодиффузии в геле. Сыворотку крови больного вносят в периферические лунки агаровой пластинки, в центральную лунку вносят стандартную сыворотку акт-HBs, полученную от переболевших гепатитом В. Учет реакции производят через 48—72 ч по появлению дуг преципитации между лунками.

Наиболее простым из чувствительных методов выявления ЯЯу-антигена является РНГА. В этой реакции используют эритроцитарный антительный диагностикум, т.е. эритроциты, нагруженные гипериммунным анти-ЯА-иммуноглобулином. Чувствительность РНГА в 100 раз выше, чем реакции преци­питации в геле. К наиболее чувствительным реакциям отно­сится ИФА, основанный на принципе "сандвича". Первона-

чально на поверхности твердой фазы (полимера) адсорбируют анти- -антитела из стандартной сыворотки. Обычно исполь­зуют лунки микротитрационных панелей. На втором этапе в отмытые лунки вносят исследуемую сыворотку крови больного. При наличии -антигена он связывается фиксированными на твердой фазе антителами. На третьем этапе добавляют анти- -антитела, несущие ферментную метку. В качестве метки используют фермент пероксидазу. Для выявления связанных антигеном меченых антител в отмытые лунки добавляют суб­страт — пероксид водорода и хролюген — ортофенилендиамин, который окисляется в присутствии кислорода, выделяющегося при разложении пероксида водорода под воздействием фер­мента с образованием продуктов желто-коричневого цвета. Степень окраски отражает интенсивность связывания меченых антител, которая пропорциональна количеству -антигена в исследуемой сыворотке.

Реакции РНГА, ИФА, РИА и другие могут быть использованы и для выявления -антигена в исследуемой сыворотке.

В биоптатах печени при активной форме инфекции можно выявить наличие НВс-антигена, ассоциированного с гепатоци-тами, методом ИФ.

Молекулярно-биологические исследования. Ви­русные ДНК в крови пациента обнаруживают с помощью ПЦР или метода ДНК-зондов.

Серодиагностика.На разных стадиях заболевания и при раз­ных формах инфекции (острой, хронической, вирусоноситель-стве) в крови присутствуют антитела к разным антигенам ви­руса гепатита В (HBs, HBc, НВе), что используют с целью диагностики (см. табл. 20.1.1). Для определения антител при­меняют различные серологические реакции: РНГА, ИФА, РИА и др. (см. выше).

Так, для выявления анти- -антител в исследуемой сыво­ротке необходим соответствующий эритроцитный диагности-кум — эритроциты, нагруженные стандартным -антигеном. Реакцию, как правило, ставят с парными сыворотками. В тесте ИФА на поверхности твердой фазы адсорбируют стандартный -антиген, на втором этапе вносят исследуемую сыворотку в десятикратных разведениях, инкубируют, отмывают и добав­ляют меченую антиглобулиновую сыворотку.

Выявление антител к -антигену свидетельствует об ак­тивной инфекции и является одним из методов контроля крови доноров. Определение анти- IgM является ведущим мето­дом дифференциальной диагностики острого и хронического активного вирусного гепатита В.

• Микробиологическая диагностика вирусного гепатита С МАТЕРИАЛ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ: кровь.

МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ:

Экспресс-методы диагностики.Молекулярно-биологи­ческие исследования. Вирусную РНК в крови пациента обнаруживают с помощью ПЦР или методом ДНК-зондов.

Серодиагностика.Является ведущим методом диагностики хронического вирусного гепатита С и контроля крови доноров. Противовирусные антитела в крови пациентов определяют с помощью чувствительных серологических реакций (ИФА, РИА и др.) с рекомбинантным вирусным антигеном. Необходимо иметь в виду, что в остром периоде заболевания антитела в крови присутствуют в низком титре ичасто в комплексе с антигеном, поэтому их выявление не всегда удается.

• Микробиологическая диагностикавирусного гепатитаD
МАТЕРИАЛ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ: кровь.
МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ:

Экспресс-методы диагностики: иммунохимические и молеку­лярно-биологические исследования.Иммунохимические ис­следования. Присутствие дельта-антигена в крови можно определить с помощью чувствительных серологических реак­ций ИФА, РИА и др.

Молекулярно-биологические исследования. Вирус­ную НК в исследуемом материале обнаруживают с помощью ПЦР или метода ДНК-зондов.

Серодиагностика.Является ведущим методом диагностики вирусного гепатита D и контроля крови доноров. Антитела к дельта-антигену в крови пациентов определяют с помощью чувствительных серологических реакций (ИФА, РИА и др.).

• Микробиологическая диагностика вирусного гепатита G
МАТЕРИАЛ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ: кровь.
МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ:

Экспресс-методы диагностики: иммунохимические и молеку­лярно-биологические исследования:

Иммунохимические исследования. Присутствие анти­генов вируса гепатита G в крови можно определить с помощью чувствительных серологических реакций ИФА, РИА и др.

Молекулярно-биологические исследования. Вирус­ную НК в исследуемом материале обнаруживают с помощью ПЦРили метода ДНК-зондов.

Серодиагностика.Является ведущим методом диагностики вирусного гепатита G и контроля крови доноров. Антитела к антигенам вируса гепатита G в крови пациентов определяют с помощью чувствительных серологических реакций (ИФА, РИА и др.).