Мобильные генетические элементы эукариот

МГЭ эукариот составляют около 10 – 30 % генома. Они рассеяны по геному, но иногда могут концентрироваться в определенных участках хромосомы. МГЭ перемещаются как внутри хромосомы, так и между ними. При этом транспозиции МГЭ происходят очень

редко, одно перемещение часто приходится на многие тысячи особей. МГЭ ответственны за ряд генетических явлений. У эукариот различают несколько классов МГЭ: транспозоны, ретропозоны, ретротранспозоны.

Транспозоны

Транспозоны эукариот сходны по организации с МГЭ прокариот. Они с флангов ограничены инвертированными повторами, необходимыми для их транспозиции. Наиболее хорошо изученные транспозоны эукариот – Р-элемент дрозофилы и Ас-элемент кукурузы Они представлены в геномах в 30 – 50 копиях, содержат ген транспозазы. Этот ген имеет прерывистое строение – состоит из экзонов и интронов. РНК, считанная с него, подвергается сплайсингу. Сплайсированная иРНК служит матрицей для синтеза транспозазы – белка, обеспечивающего перемещение элементов из одного участка генома в другой. При интеграции транспозонов в новый участок ДНК происходит дупликация сайта-мишени. Р-элемент при транспозиции обычно встраивается в определенный сайт с канонической последовательностью: ГГЦЦАГАС.

Ретротранспозоны с длинными концевыми повторами (ДКП)

Ретранспозоны с ДКП состоят из центральной части, называемой «тело», и имеющей размер 5000 – 8000 п.н. На их флангах располагаются прямые ДКН, состоящие обычно из 300 – 400 п.н. В составе ДКП содержатся участки, ответственные за инициацию транскрипции и полиаденилирование. Ограничивают ретротранспозон короткие прямые повторы, возникшие в результате дупликации сайта-мишени при его встраивании. Число копий ретротранспозонов, принадлежащих к одному семейству, в геноме варьирует от

нескольких до сотен тысяч.

Ретротранспозоны без ДКП

Данный тип МГЭ на флангах не содержит ДКП, в связи с этим они и получили свое название – ретротранспозоны без ДКП. В их перемещении участвуют ферменты обратная транскриптаза и интеграза. В связи с этим не трудно догадаться, что механизм перемещения ретротранспозонов без ДКП включает обратную транскрипцию. На начальном этапе транспозиции происходит транскрипция ретротранспозона. Образовавшаяся РНК служит матрицей для синтеза белков, участвующих в перемещении ретротранспозона без ДКП. В тоже время РНК-копия ретротранспозона, связываясь в

области разрыва ДНК с одной из ее цепей, выступает в качестве матрицы для синтеза комплементарной цепи ДНК при участии обратной транскриптазы. После завершения синтеза этой цепи ДНК РНК удаляется и достраивается вторая цепь ДНК.

Ретропозоны

Ретропозоны представляют собой интегрированные в геном ДНК-копии, синтезированные на различных РНК. Они ограничены короткими прямыми повторами. Существование ретропозонов свидетельствует о том, что возможен поток информации от РНК к ДНК.

Ретропозоны широко распространены среди эукариот. Они обнаружены в геномах млекопитающих, птиц, амфибий, насекомых. У млекопитающих ретропозоны составляют более 10 % от всей ДНК. Некоторые ретропозоны являются псевдогенами. Последние в

отличии от нормальных генов не экспрессируются с образованием функционально активного продукта.

Мини-транспозоны

Для переноса генов особенно удобны мини-Ми фаги (Resibois et al., 1981). Так называют фаги Ми, у которых после операций in vivo (или in vitro) утрачиваются литические функции, но сохраняются, по крайней мере, концы ДНК и ген А (например, Ми18Л). Без фага-помощника мини-Mu фаги могут интегрироваться в бактериальную хромосому, образовывать делеций и вызывать слияние репликонов. Если же у мини-Mu фага сохраняются и другие ранние функции, как, например, у МиА26, он, кроме того, способен осуществлять перенос бактериальных фрагментов. Мини-Mu фаг Ми40, утративший все существенные гены, переносит гены только в присутствии фага-помощника. Крут возможностей мини-Ми фагов существенно расширился после введения в них различных репликаторов, маркеров антибио-тикоустойчивости и генов-репортеров (Groisman, Casadaban, 1986). Это позволило не только извлекать гены из хромосомы и переносить их, но также проводить их анализ и мультипликацию (клонирование).

Мини-Mu фаги отличаются целым рядом преимуществ перед другими транспозонами в плане осуществления геномных перестроек и клонирования ДНК in vivo:

1) у них высока частота транспозиции;

2) нет специфичности к сайтам интеграции;

3) достаточно широк круг хозяев;

4) ими можно управлять с помощью термочувствительного репрессора (продукт гена с);

5) мини-Ми ДНК упаковывается in vivo в фаговые головки, поэтому ее можно переносить в другие клетки путем их инфекции.

Фаги Ми и мннн-Ми могут трансдуцировать бактериальные гены благодаря тому, что на концах их ДНК (в основном на правом конце, где локализуется ген S) имеются вариабельные по длине и нуклеотидным последовательностям участки бактериальной ДНК. На 5-концах эти участки достигают 1—2 т.п.н. Их размер определяется разностью между емкостью фаговой головки (38 т.п.н.) и длиной Ми ДНК (37 т.п.н.). Здесь может располагаться целый бактериальный ген, который фаг Ми способен переносить и который с частотой 10~9—10~7 может встроиться в бактериальную хромосому за счет RecA-зависимой рекомбинации. Фаг мини-Mu осуществляет ту же трансдукцню с частотой на два порядка выше, так как из-за небольшого размера его ДНК (несколько тысяч пар нуклеотидов) длина участка бактериальной ДНК на ^-концах может достигать 30 т.п.н.

При репликации ДНК мини-Ми фагов некоторые фрагменты бактериальной ДНК размером до 25—30 т.п.н. могут оказаться между двумя мини-Mu ДНК, находящимися в одной ориентации. Такие структуры ведут себя как транспозоны. После упаковки в фаговые головки и последующей инъекции в клетки они способны интегрироваться в случайные места клеточной хромосомы. Этот способ RecA-независимой трансдукции получил название мини-мюдукции. Мини-мюдукцию используют, например, для переноса и интеграции методами in vivo чужеродных генов, когда RecA-зави-симая рекомбинация неприменима. Частота мини-мюдукции низка, поэтому используют мини-Mu фаги с селективным маркером. Например, в мини-Mu фаг Ми 1&4 был введен гены а, позволяющий отбирать мини-мюдуктанты по их устойчивости к ампициллину.