Ферменты - надежный разведчик.

В последние годы ферменты начали применять в качестве химических реактивов, используя их высокую избирательность, специфичность действия. Так, например, врач, чтобы успешно лечить больного, должен знать, какие изменения произошли в организме. При сахарной болезни очень важно точно определить содержание количества глюкозы в крови. Это позволяет распознать заболевание даже тогда, когда человек чувствует себя еще хорошо, а когда начато лечение — следить за его результатами.
Но с помощью химических реактивов невозможно точно определить содержание глюкозы. На помощь приходят ферменты. Нотатин вступает в реакцию только с глюкозой, не затрагивая даже близкие к ней по строению другие сахара.
Или такой пример. Человек в состоянии сильного возбуждения совершил серьезный проступок. В этих случаях очень важно установить, был ли этот человек пьян. Лабораторный анализ должен дать точный ответ. К сожалению, химические методы определения винного спирта в крови не лишены недостатков. Если же для анализа использовать специальный фермент, - ошибки не будет.
Нередко в химических реакциях ферменты применяются как своеобразные разведчики, первооткрыватели того или иного вещества. Химики называют таких разведчиков индикаторами (от латинского слова индикатор — указатель). Они позволяют быстро установить присутствие определенных химических веществ или уловить конец реакции.
Поскольку мы знаем, что ферменты - это белки, следовательно, получение искусственных ферментов является частью большой проблемы создания, синтеза белка. Она пока еще не решена до конца.

Немного истории о ферментах.

Почти полтораста лет назад русский ученый К. С. Кирхгоф сделал интересное открытие: он заметил, что процесс превращения крахмала в сахар протекает значительно быстрее, если к крахмалу добавить ячменного солода. Отчего это происходит - науке тогда еще не было известно. Кирхгоф предположил, что в солоде содержится какое-то вещество, способное ускорять химические превращения. Затем уже другие ученые обнаружили ряд веществ, которые подобным образом влияли на ход самых разнообразных химических реакций. Такое явление получило название катализа. А таинственные вещества, осуществляющие этот процесс, стали называться ферментами (от латинского слова ферментум — брожу).
Учение о ферментах развивалось медленно. Исследователи многих стран настойчиво пытались раскрыть природу этих соединений. Был выделен не только фермент амилаза из ячменного солода, но обнаружены и другие: эмульсин в горьких миндалях, пепсин в желудочном соке, трипсин в соке поджелудочной железы. Однако строение их еще долгое время оставалось загадкой.
Что же представляют собой ферменты? Подойти вплотную к разрешению этого вопроса впервые удалось русской исследовательнице М.М.Манассеиной. Она доказала, что ферменты могут существовать не только внутри живых клеток, но и вне их.
Позднее, в трудах таких выдающихся русских ученых, как А.Я.Данилевский и И.П.Павлов, появились ясные указания на белковую природу ферментов. В то время весь мир знал об открытиях И.П.Павлова, которые произвели полный переворот в учении о пищеварении и пищеварительных ферментах. Исключительно наглядными опытами он показал, что чем больше белка в желудочном соке, тем выше его ферментативная активность. Другими словами, содержание фермента здесь всегда пропорционально количеству белка.
Вскоре другим исследователям, американцам Дж. Самнеру и Д. Нортропу, удалось получить ряд ферментов в чистом, кристаллическом виде и доказать, что они являются белками. Таким образом, учение о ферментах из области догадок перешагнуло в сферу точного исследования.

Биохимические основы молочнокислого брожения.

Биохимические и физико-химические процессы при производстве кисломолочных продуктов

План

1. Брожение лактозы.

2. Коагуляция казеина.

3. Биохимические свойства кисломолочных продуктов.

4. Биотехнология в переработке молока.

Основные биохимические процессы, протекающие при выработке кисломолочных продуктов - это молочнокислое и спиртовое брожение молочного сахара, протеолиз, коагуляция казеина и гелеобразование, в результате которых формируются консистенция, вкус и запах готовых продуктов.

По характеру брожения лактозы кисломолочные продукты принято делить на 2 группы: 1 - продукты, в основе изготовления которых лежит молочнокислое брожение (простокваша, ацидофилин, йогурт, творог, сметана); 2 - продукты со смешанным брожением - кефир, кумыс, курунга и др.

Протеолиз более интенсивно протекает в продуктах второй группы, по сравнению с большинством продуктов первой группы.

Брожение лактозы

При производстве большинства молочных продуктов в молоко или сливки вносят специально подобранные штаммы молочнокислых, пропионовокислых бактерий и дрожжей.

В результате жизнедеятельности микроорганизмов происходит глубокий распад молочного сахара, липидов и белков молока с образованием многочисленных химических соединений.

В основе изготовления целого ряда молочных продуктов лежат процессы глубокого распада молочного сахара под действием микроорганизмов, называемые брожением.

Существует несколько типов брожения лактозы, различающихся составом конечных продуктов.

Начальным этапом всех типов брожения является расщепление молочного сахара на глюкозу и галактозу под влиянием фермента лактазы (b-галактозидазы).

Далее брожению подвергается глюкоза.

Галактоза при участии уридиндифосфатглюкозы переходит в глюкозо-1-фосфат, который после изомеризации в глюкозо-6-фосфат включается в схему превращения глюкозы:

Галактоза + АТФ галактокиназа галактозо-1-фосфат + АДФ

Галактозо-1-фосфат + УДФГ галактозо-1-фосфат-уридилилтрансфераза УДФГал + глюкозо-1-фосфат

УДФГал 4-эпимераза УДФГ

Все типы брожения до образования пировиноградной кислоты идут с получением одних и тех же промежуточных продуктов и по одному и тому же пути - пути Эмбдена-Мейергофа.

Дальнейшие превращения пировиноградной кислоты могут идти в разных направлениях, которые будут определяться специфическими особенностями данного микроорганизма и условиями среды.

Конечными продуктами брожения могут быть молочная, пропионовая, уксусная, масляная кислоты, спирт и другие соединения.

Молочнокислое брожение является основным процессом при изготовлении заквасок, сыра и кисломолочных продуктов, а молочнокислые бактерии - наиболее важной группой микроорганизмов для молочной промышленности.

Молочнокислые бактерии по характеру продуктов сбраживания глюкозы относят к гомоферментативным или гетероферментативным.

Гомоферментативные бактерии образуют главным образом молочную кислоту (более 90%) и лишь незначительное количество побочных продуктов.

Гетероферментативные бактерии около 50% глюкозы превращают в молочную кислоту, а остальное количество - в этиловый спирт, уксусную кислоту и СО2.

Для гомоферментативных бактерий (Str. lactis, Str. cremoris, Str. diacetilactis, Lbm. bulgaricum, Lbm. acidophilum, Lbm. casei) характерным является сбраживание глюкозы по гликолитическому пути Эмбдена-Мейергофа:

C6H12O6 + 2Фн + 2АДФ ® 2C3H6O3 +2АТФ + H2O

Превращение глюкозы в пировиноградную кислоту в результате ряда последовательных реакций происходит при участии 10 ферментов.

Из 1 моль глюкозы образуется 2 моль молочной кислоты с одновременным синтезом 2 моль АТФ.

Гетероферментативные бактерии не могут сбраживать глюкозу по гликолитическому пути, так как у них отсутствует ключевой фермент альдолаза, необходимый для расщепления фруктозо-1,6-дифосфата на две молекулы триозофосфата.

Поэтому Str. citrovorus, Str. paracitrovorus, Lbm. brevis сбраживают глюкозу пентозофосфатным путем:

C6H12O6 + Фн + АДФ ® C3H6O3 + C2H5OH + CO2 +АТФ

В ходе реакций по пентозофосфатному пути из каждого моль глюкозы образуется моль молочной кислоты, моль этанола и CO2.

В аэробных условиях возможно образование двух молекул АТФ, тогда ацетилфосфат превращается не в этанол, а в уксусную кислоту.

Спиртовое брожение глюкозы имеет место при выработке кефира, кумыса, курунги и других кисломолочных продуктов.

Возбудителями спиртового брожения являются дрожжи Sacch. cartilaginosus, Sacch. fragilus, Sacch. cerevisiae и др. Они сбраживают глюкозу с образованием этанола и углекислоты:

C6H12O6 + 2Фн + 2АДФ ® 2C2H5OH + 2CO2 +2АТФ.

Возбудителем пропионовокислого брожения являются пропионовокислые бактерии Propionibacterium, которые превращают глюкозу или молочную кислоту в пропионовую и уксусную кислоты.

Пропионовокислое брожение углеводов и молочной кислоты играет важную роль в процессе созревания твердых сыров с высокой температурой второго нагревания:

3C6H12O6 + 8Фн + 8АДФ ® 4CH3CH2COOH + 2CH3COOH + 2CO2 + 2H2O + 8АТФ.

Маслянокислое брожение происходит в молочных продуктах под действием маслянокислых бактерий (Cl. butyricum и др.), сбраживающих как глюкозу, так и молочную кислоту.

Известно несколько типов маслянокислого брожения, различающихся образующимися продуктами. Например:

2C6H12O6 + 2H2O + 7Фн + 7АДФ ® CH3CH2CH2COOH + 2CH3COOH + 4CO2 + 6H2 + 7АТФ.

При других типах маслянокислого брожения наблюдается образование бутилового и изопропилового спиртов, этанола, ацетона.

Маслянокислое брожение является причиной порчи кисломолочных продуктов и является нежелательным процессом в молочной промышленности.

Коагуляция казеина

Важнейшими процессами, происходящими при выработке кисломолочных продуктов, являются коагуляция казеина и гелеобразование (переход коллоидной системы молока из свободнодисперсного состояния, золя, в связаннодисперсное состояние - гель).

Коагуляция казеина при производстве кисломолочных продуктов может осуществляться двумя способами - кислотным или сычужным.

Кислотная коагуляция казеина вызывается молочной кислотой, которая накапливается в молочных продуктах в результате брожения лактозы. Молочная кислота снижает отрицательный заряд мицелл казеина и переводит его в изоэлектрическое состояние (рН 4,6-4,7), в котором макромолекулы белка теряют свою растворимость и устойчивость. Кроме того, происходит переход в плазму фосфата кальция и органического кальция казеинаткальцийфосфатного комплекса, что дестабилизирует мицеллы казеина и вызывает их диспергирование.

Сычужная коагуляция казеина включает 2 стадии - ферментативную и коагуляционную. Механизм как первой, так и второй стадии окончательно не установлен. Наиболее убедительной считается теория протеолитического действия сычужного фермента (гидролитическая теория). Согласно этой теории, на первой стадии под действием основного компонента сычужного фермента химозина происходит разрыв пептидной связи фенилаланин-метионин в полипептидных цепях k-казеина ККФК, в результате чего молекулы k-казеина расщепляются на гидрофобный пара-k-казеин и гидрофильный гликомакропротеид. Гидратная оболочка мицелл частично разрушается, силы электростатического отталкивания между частицами уменьшаются и дисперсная система теряет устойчивость. На второй стадии частично дестабилизированные мицеллы казеина (параказеина) собираются в агрегаты, которые затем соединяются продольными и поперечными связями в единую сетку, образуя сгусток.

Процесс гелеобразования - агрегирование частиц казеина и формирование единой пространственной сетки молочного сгустка.

Независимо от способа коагуляции, различают 4 стадии формирования сгустка:

1 - индукционный период;

2 - сдадия флоккуляции - массовая коагуляция;

3 - стадия метастабильного равновесия - уплотнение сгустка;

4 - стадия синерезиса - самопроизвольное уплотнение структуры за счет перегруппировки частиц и увеличения числа контактов между ними, т.е. сжатие геля и выпрессовывание из него дисперсионной среды.

При структурообразовании дисперсных систем могут образовываться два типа пространственных структур - коагуляционные (тиксотропно-обратимые) и конденсационные (необратимо-разрушающиеся). Коагуляционные структуры обладают эластичностью, пластичностью и малой прочностью, так как частицы удерживаются только межмолекулярными силами. В конденсационных структурах частицы соединены прочными химическими связями, которые обеспечивают их прочность, но делают их хрупкими, неэластичными.

Сгустки кисломолочных продуктов имеют, как правило, смешанный характер с преобладанием необратимо-разрушающихся либо тиксотропно-обратимых связей. Соотношение этих связей зависит от целого ряда факторов, правильное использование которых позволяет получать сгустки с заданными свойствами.