Применение ферментов в качестве лекарственных средств

Использование ферментов в качестве терапевтических средств имеет много ограничений вследствие их высокой иммуногенности. Тем не менее энзимотерапию активно развивают в следующих направлениях:

· заместительная терапия – использование ферментов в случае их недостаточности;

· элементы комплексной терапии – применение ферментов в сочетании с другой терапией.

Заместительная энзимотерапия эффективна при желудочно-кишечных заболеваниях, связанных с недостаточностью секреции пищеварительных соков. Например, пепсин используют при ахилии, гипо- и анацидных гастритах. Дефицит панкреатических ферментов также в значительной степени может быть компенсирован приёмом внутрь препаратов, содержащих основные ферменты поджелудочной железы (фестал, энзистал, мезим-форте и др.).

В качестве дополнительных терапевтических средств ферменты используют при ряде заболеваний. Протеолитические ферменты (трипсин, химотрипсин) применяют при местном воздействии для обработки гнойных ран с целью расщепления белков погибших клеток, для удаления сгустков крови или вязких секретов при воспалительных заболеваниях дыхательных путей. Ферментные препараты стали широко применять при тромбозах и тромбоэмболиях. С этой целью используют препараты фибринолизина, стрептолиазы, стрептодеказы, урокиназы.

Фермент гиалуронидазу (лидазу), катализирующий расщепление гиалуроновой кислоты, используют подкожно и внутримышечно для рассасывания рубцов после ожогов и операций (гиалуроновая кислота образует сшивки в соединительной ткани).

Ферментные препараты используют при онкологических заболеваниях. Аспарагиназа, катализирующая реакцию катаболизма аспарагина, нашла применение для лечения лейкозов.

Предпосылкой антилейкемического действия аспарагиназы послужило обнаружение в лейкозных клетках дефектного фермента аспарагинсинтетазы, катализирующего реакцию синтеза аспарагина.

Лейкозные клетки не могут синтезировать аспарагин и получают его из плазмы крови. Если имеющийся в плазме аспарагин разрушать введением аспарагиназы, то в лейкозных клетках наступит дефицит аспарагина и в результате – нарушение метаболизма клетки и остановка прогрессирования заболевания.

Иммобилизованные ферменты – это ферменты, связанные с твердым носителем или помещенные в полимерную капсулу. Для иммобилизации ферментов используют два основных подхода:

1. Химическая модификация фермента.

2. Физическая изоляция фермента в инертном материале.

Часто для иммобилизации ферментов используют капсулы из липидов – липосомы, которые легко проходят через мембраны и оказывают необходимые эффекты внутри клетки. Преимущества

иммобилизованных ферментов:

1. Легко отделяются от реакционной среды, что позволяет использовать фермент повторно. Продукт не загрязнен ферментом.

2. Ферментативный процесс можно осуществлять непрерывно.

3. Повышается стабильность фермента.

Иммобилизированные ферменты можно использовать для аналитических и препаративных целей. Существуют несколько типов устройств, где иммобилизированные ферменты применяются в аналитических целях – ферментные электроды, автоматические анализаторы, тест-системы и т.д.

Препаративное использование иммобилизованных ферментов в промышленности:

1. Получение L-аминокислот с помощью аминоацилазы.

2. Получение сиропов с высоким содержанием фруктозы с использованием глюкозоизомеразы.

3. Обработка молока.

ГЛАВА 5
СТРУКТУРА И ФУНКЦИИ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ

Нуклеиновые кислоты – это биополимеры, состоящие из нуклеотидов и выполняющие функцию хранения, передачи и реализации генетической информации. Впервые обнаружены Фридрихом Мишером в 1869 г. в клетках, богатых ядерным материалом.

Мономерами нуклеиновых кислот являются нуклеотиды. Каждый нуклеотид содержит 3 компонента: гетероциклическое азотистое основание, моносахарид (пентозу) и остаток фосфорной кислоты. В состав нуклеиновых кислот входят азотистые основания двух типов: пуриновые – аденин (А), гуанин(Г) и пиримидиновые – цитозин(Ц), тимин(Т) и урацил(У). Кроме главных азотистых оснований в нуклеиновых кислотах присутствуют небольшие количества нетипичных (минорных) оснований (псевдоуридин, дигидроуридин, метиладенозин и др.).

Нуклеотиды, в которых пентоза представлена рибозой, называют рибонуклеотидами, а нуклеиновые кислоты, построенные из рибонуклеотидов, рибонуклеиновыми кислотами, или РНК. В молекулы РНК входят аденин, урацил, гуанин и цитозин. Нуклеиновые кислоты, в мономеры которых входит дезоксирибоза, называют дезоксирибонуклеиновыми кислотами, или ДНК. В ее состав входят аденин, тимин, гуанин и цитозин. Молекулы ДНК, как правило, состоят из 2 полинуклеотидных цепей, РНК в основном представляют собой одноцепочечные структуры.

Молекулы нуклеиновых кислот всех типов живых организмов – линейные полимеры, не имеющие разветвлений. Роль мостика между нуклеотидами выполняет 3¢,5¢-фосфодиэфирная связь, соединяющая пентозы нуклеотидов. В связи с этим полинуклеотидная цепь имеет определенную направленность. На одном её конце находится 5¢-ОН группа, этерифицированная остатком фосфорной кислоты (начало цепи), на другом – свободная 3¢-ОН-группа (конец цепи). Последовательность нуклеотидов в полинуклеотидной цепи формирует первичную структуру нуклеиновой кислоты. Углеводно-фосфатный остов цепи представляет собой неспецифический компонент нуклеотида. Функционально значащей является последовательность азотистых оснований, уникальная для каждой молекулы. Это обуславливает большое разнообразие индивидуальных ДНК и РНК. В то же время нуклеиновые кислоты обладают видовой специфичностью, т.е. характеризуются определенным нуклеотидным составом у каждого биологического вида. В клеточных организмах присутствуют оба типа нуклеиновых кислот; вирусы содержат нуклеиновую кислоту лишь одного типа – ДНК или РНК.

Биологическая рольнуклеиновых кислот заключаетсяв хранении, реализации и передаче генетической информации. Возможно, что нуклеиновые кислоты обеспечивают различные виды биологической памяти – иммунологическую, нейрологическую и т.д., а также играют существенную роль в регуляции биосинтетических процессов.

Структура и функции ДНК

ДНК имеет первичную, вторичную и третичную структуры. Первичная структураДНК – порядок чередования дезоксирибонуклеозидмонофосфатов (дНМФ) в полинуклеотидной цепи. Сокращенно эту последовательность записывают с помощью однобуквенного кода от 5¢ к 3¢ концу, например 5¢-А-Г-Ц-Т-Т-А-Ц-А-3¢. Первичная структура строго специфична и индивидуальна для каждой природной ДНК и представляет кодовую форму записи биологической информации (генетический код). Впервые доказательство генетической роли ДНК получено в 1944 г. Освальдом Эйвери с сотрудниками в опытах по трансформации, осуществленных на бактериях. Содержание нуклеотидов в ДНК, подчиняется закономерностям, выявленным Эрвином Чаргафом (1950): суммарное количество пуриновых оснований равно сумме пиримидиновых, причем количество А равно количеству Т, а количество Г – количеству Ц. Эти закономерности определяются особенностями вторичной структуры ДНК.

Вторичная структура ДНК представляет собой спираль, состоящую из двух антипараллельных полинуклеотидных цепей, закрученных относительно друг друга и вокруг общей оси. Все основания цепей ДНК расположены стопкой внутри двойной спирали, а пентозофосфатный остов – снаружи. Полинуклеотидные цепи удерживаются друг относительно друга за счет водородных связей между комплементарными основаниями. Дополнительная стабилизация спирали происходит за счет гидрофобных взаимодействий, возникающих между азотистыми основаниями в стопке. Выяснение вторичной структуры ДНК (Д.Уотсон, Ф.Крик, 1953) стало одним из величайших открытий в естествознании, так как позволило раскрыть механизм передачи наследственной информации в ряду поколений.

Третичная структураДНК различается у прокариотических и эукариотических организмов. У бактерий и вирусов, а также в митохондриях и хлоропластах эукариот ДНК имеют либо линейную, либо кольцевую форму, двух- или одноцепочечную. Двухцепочечные ДНК легко переходят в суперспирализованное состояние в результате дополнительного скручивания в пространстве двухспиральной молекулы.

Третичная структура ДНК эукариотических клеток также выражена в многократной суперспирализации молекулы, однако, в отличие от прокариот, она осуществляется в форме комплексов ДНК с гистоновыми и негистоновыми белками. Такие дезоксинуклеопротеины называются хроматином.

Выделяют следующие уровни упаковки хроматина (Рис 5.1):

1. Нуклеосомный. Четыре гистона Н2А, Н2В, Н3 и Н4 (по 2 каждого типа) образуют октамерный белковый комплекс, который называют нуклеосомным кором. Молекула ДНК накручивается на поверхность этого кора, совершая 1,75 оборота (около 146 пар нуклеотидов). Такой комплекс гистоновых белков с ДНК является основной структурной единицей хроматина и называется нуклеосомой.ДНК,соединяющую нуклеосомные частицы, называют линкернойДНК. С нею связываются молекулы гистона Н1, защищая эти участки от действия нуклеаз.

2. Соленоидный. Нуклеосомная нить скручивается в более толстые фибриллы – соленоиды. Их также называют хроматиновыми фибриллами.

3. Петлевой. Соленоидная фибрилла образует петли и дополнительно упаковывается.

4. Метафазная хромосома. Петельные домены дополнительно конденсирутся и спирализуются, приобретают четкие формы.

Рис. 5.1. Уровни организации хроматина

Негистоновые белки хроматина представлены сотнями самых разнообразных ДНК-связывающих протеинов. К этой группе относят семейство белков типа «цинковые пальцы», белки высокой подвижности (HGM-белки), ферменты репликации, транскрипции и репарации. Таким образом, при участии структурных, регуляторных белков, а также ферментов, участвующих в синтезе ДНК и РНК, нить нуклеосом преобразуется в высококонденсированный комплекс белков и нуклеиновых кислот.

Организация генома человека

Общая длина ДНК гаплоидного набора из 23 хромосом человека составляет 3,5´10⁹ пар нуклеотидов. Этого количества ДНК достаточно для создания нескольких миллионов генов. Однако истинное число структурных генов находится в области 40 тысяч. Такую избыточность ДНК объясняют как сложной организацией генов, так и наличием повторяющихся участков ДНК.

В геноме человека примерно 60% приходится на участки ДНК, представленные в виде одной или нескольких копий. Это так называемые уникальные последовательности, несущие информацию о структуре специфических белков, и представляющие собой структурные гены. Нередко уникальные последовательности образуют мультигенные семейства, располагающиеся в виде кластеров в определенных областях одной или нескольких хромосом. Примерами мультигенных семейств могут служить гены a- и b-глобинов, тубулинов, миоглобина, актина и трансферрина. В мультигенных семействах наряду с функционально активными генами содержатся псевдогены – мутационно измененные последовательности, не способные транскрибироваться или продуцирующие функционально неактивные генные продукты.

До 30% генома представлено умеренно повторяющимися последовательностями (от 10 до 10 000 копий на гаплоидный геном). Сюда относятся гены, которые кодируют продукты, необходимые клетке в больших количествах. Так, гены рРНК имеются у человека в количестве от 300 до 600 копий. Многократно повторяются гены, кодирующие тРНК, гистоны, цепи иммуноглобулинов. Чаще всего они располагаются в ДНК в виде тандемных (следующих друг за другом) повторов. В группу умеренно повторяющихся последовательностей входят и участки ДНК, которые не транскрибируются, но выполняют важные регуляторные функции (промоторы, энхансеры, сайленсеры).

Часто повторяющиеся последовательности могут присутствовать в одном геноме сотни тысяч и миллионы раз. В основном это сателлитная ДНК, сосредоточенная в центромерном и теломерном хроматине. Она состоит из простых последовательностей, формирующих кластеры (скопления нескольких сотен копий). Предполагается, что сателлиты участвуют в спаривании и расхождении хромосом. У человека на долю сателлитной приходится около 10% ДНК.