Вирусологический метод, основные этапы.
Этиологическая диагностика вирусных заболеваний проводится вирусологическим, вирусоскопическим, серологическим и молекулярно-генетическим методами. Три последних метода могут быть использованы как экспресс-диагностические.
Вирусологический метод диагностики.
Конечной целью метода является идентификация вирусов до вида или серологического варианта. Вирусологический метод включает несколько этапов:
1) отбор материала для исследования;
2) обработку вируссодержащего материала;
3) заражение материалом чувствительных живых систем;
4) индикацию вирусов в живых системах;
5) титрование выделенных вирусов;
6) идентификацию вирусов в иммунных реакциях.
1. Отбор материала для исследования.
Проводится в ранние сроки заболевания при соблюдении правил, предотвращающих контаминацию материала посторонней микрофлорой и инфицирование медицинского персонала. Для предупреждения инактивации вирусов при транспортировке материала, он помещается в вирусную транспортировочную среду (ВТС), состоящую из сбалансированного солевого раствора, антибиотиков и сывороточного альбумина. Транспортируется материал в специальном контейнере с термоизоляцией и закрытыми пластиковыми пакетами, содержащими лед. При необходимости материал хранят при -20˚С. Каждый образец материала для исследования должен иметь маркировку и этикетку с указанием фамилии больного, типа материала, даты его забора, развернутый клинический диагноз и другие сведения.
В зависимости от характера заболевания, материалом для исследования могут быть:
1) смывы с носовой части глотки и мазок из глотки;
2) спинномозговая жидкость;
3) кал и ректальные мазки;
4) кровь;
5) моча;
6) жидкость из серозных полостей;
7) мазок с конъюнктивы;
8) содержимое везикул;
8) секционный материал.
Для получения смыва из ротоглотки используют 15-20 мл ВТС. Больной тщательно в течение 1 минуты полощет горло ВТС и собирает смыв в стерильный флакон.
Мазок с задней стенки глотки берут стерильным ватным тампоном, надавливая на корень языка шпателем. Тампон помещают в 2-3 мл ВТС, ополаскивают и отжимают.
Спинномозговую жидкость получают при спинномозговой пункции. 1-2 мл спинномозговой жидкости помещают в стерильную посуду и доставляют в лабораторию.
Пробы кала отбирают в течение 2-3 дней в стерильные флаконы. Из полученного материала готовят 10 % суспензию с использованием раствора Хенкса. Суспензию центрифугируют при 3000 об/мин, собирают надосадочную жидкость, вносят в нее антибиотики и помещают в стерильную посуду.
Кровь, полученную при венепункции в объеме 5-10 мл, дефибринируют путем добавления гепарина. Цельную кровь не замораживают, антибиотики не добавляют. Для получения сыворотки пробы крови выдерживают в термостате при 37˚С в течение 60 минут.
Жидкость из серозных полостей получают при их пункции в количестве 1-2 мл. Жидкость используется сразу или сохраняется в замороженном состоянии.
Мазок с конъюнктивы берут стерильным тампоном и помещают в ВТС, после чего проводят центрифугирование взятого материала и его замораживание.
Содержимое везикул отсасывают шприцем с тонкой иглой и помещают в ВТС. Материал посылается в лабораторию в виде высушенных мазков на предметных стеклах или в запаянных стерильных капиллярах или ампулах.
Секционный материал отбирают в возможно ранние сроки, соблюдая правила асептики. Для отбора каждой пробы используют отдельные наборы стерильных инструментов. Количество отбираемых тканей составляет 1-3 г, которые помещают в стерильные флаконы. Вначале берут пробы внеполостных органов (мозг, лимфатические узлы и др.). Ткани грудной полости берут до вскрытия брюшной полости. Полученные образцы тканей растирают в ступке с добавлением стерильного песка и стерильного раствора натрия хлорид, после чего материал центрифугируют. Надосадочную жидкость собирают во флаконы, добавляют антибиотики. Материал для вирусологического исследования используется сразу или хранится при -20˚С.
2. Обработка вируссодержащего материала.
Проводится с целью освобождения материала от сопутствующей бактериальной микрофлоры. Для этого используются физические и химические методы.
Физические методы:
1) фильтрование через различные бактериальные фильтры;
2) центрифугирование.
Химические методы:
1) обработка материала эфиром в случаях выделения вирусов, не имеющих суперкапсида;
2) добавление к материалу смеси гептана и фреона;
3) внесение антибиотиков (пенициллин – 200-300 ЕД/мл; стрептомицин – 200-500 мкг/мл; нистатин – 100-1000 ЕД/мл).
3. Заражение материалом чувствительных живых систем.
Поскольку вирусы являются облигатными внутриклеточными паразитами, для их размножения используют следующие живые системы:
1) лабораторные животные;
2) куриные эмбрионы;
3) культуры органов;
4) культуры тканей.
Лабораторные животные. Используются белые мыши, морские свинки, хомяки, кролики и др. Белые мыши наиболее чувствительны к большому числу видов вирусов. Способ заражения животных определяется тропизмом вируса к тканям. Заражение в мозг применяется при выделении нейротропных вирусов (вирусы бешенства, полиовирусы и др.). Интраназальное заражение проводят при выделении возбудителей респираторных инфекций. Широко используются внутримышечный, внутривенный, внутрибрюшинный, подкожный и другие методы заражения. Заболевших животных усыпляют эфиром, вскрывают и производят забор материала из органов и тканей.
Куриные эмбрионы. Широко доступны и просты в работе. Применяют куриные эмбрионы в возрасте от 5 до 14 дней. Перед заражением куриные эмбрионы овоскопируют: определяют их жизнеспособность, отмечают на скорлупе границу воздушного мешка и месторасположение эмбриона («темный глаз» эмбриона). Работа с куриными эмбрионами проводится в стерильном боксе стерильными инструментами (пинцеты, шприцы, ножницы, копье и др.). После выполнения фрагмента работы инструменты погружают в 70 % этиловый спирт и перед следующей манипуляцией прожигают. Перед заражением скорлупу куриного эмбриона протирают горящим спиртовым тампоном и спиртовым раствором йода. Объем исследуемого материала, вводимого в эмбрион, составляет 0,1-0,2 мл. Для выделения вирусов из одного материала используют не менее 4 куриных эмбрионов.