Эндотелиальная дисфункция и сахарный диабет.

При сахарном диабете установлено повреждение системы NOS (131, 164): снижен уровень NO в эндотелии, нарушена эндотелий – зависимая дилатация сосудов (168), которая восстанавливалась на фоне лечения L – аргинином. У больных сахарным диабетом значительно повышеныактивность эндотелиальной НАД (Ф) Н- оксидазы и соответственно уровень супероксид радикалов, что коррелирует со степенью нарушения эндотелий – зависимой вазодилатации (177). Эффект, вероятно, связан с образованием у таких больных повышенных уровней ОN ОО-.

Гипертгликемия при сахарном диабете, возможно, зависит от функции эндотелия(161). На изолированных сегментах сосудов, полученных у животных с сахарным диабетом, показано нарушение эндотелий – зависимого расслабления, которое можно было вызвать инкубацией нормальных сосудов при высокой концентрации глюкозы(166). Гипергликемия активирует в эндотелиальных клетках протеинкиназу С, что может вызывать увеличение выработки сосудосуживающих простагландинов, эндотелина и ангиотензинпревращающего фермента, которые обладают непосредственным или опосредованным повреждающим действием на сосудодвигательную реактивность (33). Более того, гипергликемия нарушает продукцию матрикса эндотелиальными клетками, что может привести к увеличению толщины основной мембраны. Гипергликемия увеличивает синтез эндотелиальными клетками коллагена 1V типа и фибронектина с увеличением активности ферментов, вовлеченных в синтез коллагена(160). Целый ряд метаболических и гемодинамических факторов могут оказывать влияние на дисфункцию эндотелия у больных диабетом и АГ. Гиперхолестеринемия, а, возможно, и гипертриглицеридемия нарушают эндотелий – зависимое расслабление. Как инсулин, так и инсулиноподобный фактор роста (ИФР) могут оказывать влияние на эндотелиальные клетки путем стимуляции синтеза ДНК. Существует гтпоетза, что эндотелиальная дисфункция при диабете связана с увеличением активности протеинкиназыв сосудистом эндотелии, что приводит к увеличению тонуса сосудов и развитию атеросклероза (148). Инициирующую роль в формировании ЭД у больных диабетом отводят накоплению конечных продуктов гликозилирования белков в субэндотелиальном пространстве и активация свободнорадикальныхпроцессов с увеличением продукции супероксид – анионов (146). Конечные продукты гликозилирования являются самостоятельными атерогенными факторами, поскольку способствуют повышению проницаемости эндотелия, усилению адгезии клеток крови, активации хемотаксиса моноцитов/макрофагов в артериальную стенку, пролиферацию ГМК. Гликозилирование способствует генерации супероксидных и гидроксильных радикалов, инициирующих окисление липопротеидов низкой плотности (ЛПНП). При пассаже через эндотелий ЛПНП подвергаются окислению и в интиму проникают в основном наиболее атерогенные перекисно – модифицированные ЛПНП, обладающие прямым цитотоксическим действием. Вызывая повреждение эндотелия, они стимулируют адгезию моноцитов на его поверхности, с факторами свертывания, активизируя экспрессию тромбопластина и ингибитора активации плазминогена, угнетают продукцию вазодилататоров и усиливают - вазоконстрикторов. Кроме того, кумулируясь в субэндотелиальном пространстве, они приобретают свойства макрофагов. Макрофаги секретируют биологически активные соединения, включая хемотаксины, митогены и факторы роста, которые стимулируют миграцию из меди в интиму ГМК и фибробластов, их пролиферацию, репликацию и синтез соединительной ткани. Результатом этих процессов является деицит оксида азота и, как следствие, нарушение инициируемых им реакций, что, возможно, является одним из звеньев патогенеза диабетических осложнений, связанных с поражением сосудов у этой категории больных (171). Нарушение продукции вазодилатирующих факторов в эндотелии реализуется в повышении реактивности микрососудов, выражающемся в усилении ответа на сосудосуживающие агенты. Основной причиной смерти при СД – 1 ого типа являются сердечно – сосудистые осложнения, обусловленные развитием макро – и микроангиопатий. Главная роль в развитии этих осложнений СД принадлежит гипергликемии, которая запускает ряд патологических механизмов. Основные механизмы, определяющие развитие микро – и макроангиопатий, - это ЭД, оксидативный стресс и нарушение реологических свойств крови и гемостаза. При диабетической микроангиопатии поражаются венулы, артериолы, капилляры сердца, мозга, почек, верхних и нижних конечностей, сетчатки глаз. Диабетическая микроангиопатия характеризуется утолщением базальной мембраны, отложением в ней иммунных комплексов, пролиферацией эндотелия вследствие нарушения обмена полисахаридов, повышением проницаемости сосудистой стенки для белков и других макромолекул в сосудистой стенке, снижением кровотока, что приводит к гипоксии и ухудшению питания эндотелия(146). Установлено, что степень выраженности ангиопати и зависит от длительности течения диабета, в частности, при длительности заьболевания более 10 лет, у больных с ангиопатией нижних конечностей частично сохранены антитромбогенные свойства сосудистой стенки и изменения гемостаза у этой категории больных в основном носят функциональный характер (частично сгохранена активность сосудистой стенке по синтезу и секреции простациклина и других антиагрегантов, антитромбина 111, тканевых активаторов плзминогена). При продолжительной болезни эндотелиальная антитромбогенная активность резко снижена, что проявляется как угнетением выработки дезагрегантов и антикоагулянтов, так и подавлением фибринолиза приводящих к ускорению процесса внутрисосудистого свертывания крови. У страдающих СД часто обнаруживается крайне акселерированная форма артенриосклеротических изменений, в качестве ее причины обсуждается дисфункция эндотелия, вызванная хронически повышенным уровнем сахара в крови, в экспериментальных исследованиях было показано, что повышенная концентрация глюкозы приводит кпарадоксальной вазоконстрикции, как реакции на введение ацетилхолина. Очевидно, причинную роль здесь играет не столько нарушение обмена NO , сколько усиленное образование действующих вазоконстрикторных простагландинов, который противодействуют вызываемой NO вазодилатации. Наряду с классическими факторасмри риска атеросклеротических изменений сосудов, на развитие эндотелиальной дисфункции при сниженной актвности синтеза NO, возможно, оказывает влияние и недостаток фихзической активности.

10.Принципы диагностики эндотелиальной дисфункции

Диагностика и коррекция ЭД сегодня является новым и наиболее перспективным в развитии кардиологии. Оценка ЭД основана на тестах по определению эндотелий- зависимой подвижности сосудов (способность к расслаблению периферических и коронарных артерий). Алгоритм включает в себя инструментальные и лабораторные методы. Наиболее распространенным методом верификации маркеров эндотелиальных аномалий является сонография, в частности : Оценивают результаты ультразвукового исследования сердца, лучевой и сонной артерий; При поражении сосудов мозга производят транскраниальное дуплексное ангиосканирование; Изучают эндотелий – зависимую дилатацию плечевой артерии методом дуплексного сканирования; Используют пробу с реактивной гиперемией и внутрикожным введением адреналина, срегистрацией показателя объемной скорости кожного кровотоква для изучения функциональнорго состояния эндотелия микрососудов.

В качестве потенциальных маркеров дисфункции эндотелия рассматривается несколько субстанций, продукция которых может отражать функцию эндотелия: тканевой активатор плазминогена и его ингибитор, тромбомодулин, фактор Виллебранда, уровень стабильных метаболитов NO (нитратов и нитритов) в сыворотке крови или моче, а так же косвенная оценка уровня и / или активности NO – образующего фермента еNOS.

Одним из методов оценки выраженности ЭД, является анализ содержания в крови веществ, выделяемых сосудистой стенкой, или исследования содержания в крови факторов, повреждающих эндотелий, уровень которых достоверно коррелирует с ЭД. К таким факторам (медиаторам повреждения эндотелия) относятся: гиперхолестеринемия, гипергомоцистеинемия, цитокины (IL -1b , TNF- а, IL -8 и другие).

По скорости образования в эндотелии различных факторов. А так же по преимущественному направлению их секреции (внутриклеточные или внеклеточные) вещества эндотелиального происхождения можно рахделить на следующие группы:

1. Факторы, постоянно образующиеся и выделяющие из клеток в базолатеральном направлении или в кровь ( NO простациклин).
2. Факторы, накапливающиеся в эндотелии и выделяющие из него при стимуляции (фактор Виллебранда, Р – селектин, тканевой активатор плазминогена). Эти факторы могут попадать в кровь не только при стимуляции эндотелия. но и при его активации и повреждении.
3. Факторы, синтеза которых в нормальных условиях практически не происходит, однако он резко увеличивается при активации эндотелия (эндотелин 1, ICAM-1 VCAM-1, Е – селектин, PAI- 1).
4. Факторы, синтезируемые и накапливающиеся в эндотелии ( t PA), либо являющиеся мембранными белками (рецепторами) эндотелия (тромбомодулин, рецептор протеина С).

Дисфункция эндотелия может быть самостоятельной, причиной нарушения кровообращения в органе, поскольку нередко провоцирует ангиоспазм или тромбоз сосудов, что в частности, наблюдается при некоторых формах ИБС. С другой стороны, нарушение регионарного кровообращения ( ишемия, венозный застой) тоже могут приводить к ЭД. К наиболее часто исследуемым в практике циркулирующим маркерам ЭД относят: эндотелиин -1, оксид азота и его метаболиты, фактор Виллебранда, тканевой активатор плазминогена, ингибитор активатора плдазминогена, в – тромбоглобулин, 4 антитромбоцитарный фактор(24, 42, 72)

Гуморальные компоненты ЭД

Семейство селектинов. Семейство адгезивных белков, которые имеют три характерные черты: вариабельное число (от 2до 9) повторов комплемент – регуляторных белков, домен эпиермального фактора роста (EGF) и N концевой лектиновый домен. Хорошо охарактеризованы три члена этого семейства: L –селектин, Р – селектин, Е – селектин. Селектины являются тканевыми лектинами, оюладающими сродством к концевым остаткам маннозы, для связывания которых требуется присутствие Са 2+ (своийства группы селектинов). Под действием Р – и Е – селектинов осуществляется частичная задержка лейкоцитов с неполной остановкой на поверхности эндотелия – роллинг: при этом Р – селектин обеспечивает начальную стадию – быстрый роллинг лейкоцитов, скорость которого начинает замедляться при экспрессии Е – селектина.

Растворимый L -селектин (sL –selektin) (синонимы: sCD 62L SLECAM – L), Гликопротеин, предшественник мембранного предшественника L –selektin, молекулярной массой 75 – 80 кДа. L –селектин экспрессируется на лимфоцитах и имеет прямое отношение к их миграции. Данный белок так же представлен на нейтрофилах, моноцитах, и других миелоидных клетках. Показано, что L –селектин опосредует эффект «катящихся» нейтрофилов вдоль стенки микроциркуляторно русла – феномен, который многие исследователи рассматривают как первый «шаг» адгезии лейкоцитов к эндотелию, что, в свою очередь, приводит к накоплению в зоне воспаления. Металлопротеиназы клеточной поверхности расщепляют L –селектин , что может снижать регуляцию L –селектин – опосредованной адгезии. () Изучение циркулирующего L –селектина, возможно даст понятие сути патогенетических механизмов при сахарном диабете, заболеваниях вен, бактериальных и других инфекций и других.

Растворимый Р – селектин (sР –selektin) Синоним:CD 62, PADGEM, GMP -140. Его роль опосредование процессов адгезии лейкоцитов к активированному эндотелию в процессе острого воспаления. Может действовать синергично с Е- селектином и опосредовать адгезию нейтрофилов в процессе острого воспаления. Чрезмерное накопление нейтрофилов на поверхности эндотелия, сопровождается высоким уровнем Р – селектина, связано со множеством протекающих процессов, включая респираторный дистресс – синдром взрослых, острое поражение легких повреждение при ишемии – реперфузии, грамм – отрицательный септический шок, тромботические заболевания и другие.

Растворимый Е – селектин (s Е –selektin) Синоним ELAM-1 Гликопептид, с массой 115 кДа, первая индуцибельная молекула , выявленная на поверхности эндотелия. Синтезируется в ответ на стимул, эндотоксинами, субстанцией Pa TNF β, α различными IL -1. , является хемотаксичным сигналом для нейтрофилов, усиливает способность к миграции.

МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЭД

Исследование антитромботической активности сосудистой стенки. Спонтанную и индуцированную агрегацию тромбоцитов тромбоцитов в крови измеряют по активности тромбоцитов на агреометрах различного типа под действием индуктора агрегации – АДФ (конечная концентрация 1х10 *5 М), адреналина (конечнаяконцентрация 10 мкг/мл), тромбина ( активностью 1,0 – 1,5 NIH Ед/мл), растворимого фибрина - фибрин – мономеов (конечная концентрация – 2,3 мкг/мл), коллагена (конечная концентрация 20 мг/мл), ристомицина (конечная концентрация -0,17 мкг/мл). Определение доступности 3 пластинчатого фактора определяют по каолин – лебетоксиновому тесту. (8)

Количественное определение фактора Виллебранда (фВ)

Определение фВ в плазме крови возможно фотоэлектрокалориметрическим методом или количественным иммуноферментным методом на анализаторе «Vidas» (Франция). Исследуют так же влияние плазминного vWF на агглютинацию тромбоцитов под воздействием ристомицина. Материал – цитратная кровь пациента. Референтные величины: 80 – 120% Определение тканевого активатора плазминогена (t- PA), урокиназного активатора плазминогена (u – PA), ингибитора активации плазминогена первого типа (PAI- 1) возможно как иммуноферментным, так и использованием фотокалориметрических методов.

А. Опредление активности плазминогена на фибриновых пластинах.

Принцип. К фибрину, который образовался на чашках Петри в результате свертывания фибриногена тромбином, добавляют плазму или эуглобулиновую фракцию. Активатор плазминогена превращает плазминоген в плазмин, лизирующий фибрин пропорционально своей активности. Ход определния. 0,25 мл плазмы или эуглобулиновой фракции выливают в центр каждой половины фибриновой плвстины. Пластины инкубируют при t 37*С 24 часа, а затем измеряют площадь лизиса. Нормальные величины. Плазма здоровых людей менее чем 100 мм2 пластины, эуглобулиновая фракция плазмы – 200 мм2

Б. Колорметрическое определение тканевого активатора плзминогена. (ТАП) Методом хромогенных субстратов. Принцип. В присутствии активатора плазминогена зи эквивалентных количеств плазминогена и фибрина образуется дополнительное кол – во плазмина, который вытесняет Р – нитроаналин из хромогенного субстрата. Ход определения. Получают цитратную плазму, из которой выделяют эуглобулиновую фракцию. По имеющимся в наборе стандартам строят калибровочную кривую.

В. Иммуноферментное определение тканевого активатора плазминогена (ТАП). Принцип. ТАП связывается со специфическими антителами, адсорбированными на тест пластинках, в эквивалентных количествах. При следующей обработке пластин, анти ТАП пероксидазов в образце остаетстя некоторое кол – во свободной, не связанной с ТАП, анти ТАП пероксидазы. Ее кол – во пропорционально содержанию ТАП и определяется фотометрически в реакции с перекисью водорода и хромогенным субстратом. Матиериал для исследования. Цитрпатная плазма, тканевойэкстракт, супернатант культуры клеток (меланома, эндотелиальные клетки ит.д.) Ход опеределения. Перед определением ТАП ннеобходисмо построить калибровочную кривую по имеющимся в наборе стандартам. Определение проводят согласно инструкции набора. Нормальные показатели 1 – 12 нг/мл.

Г. Колориметрическое определение ингибитора активатора плазминогена (ПАИ -1). Методом хромогенных субстратов.Ингибитор активатора плазминогена образуется в эндотелиальных клетках, гепатоцитах, а так же в неактиной форме может высвобождаться из тромбоцитов. Принцип. Содержащийся в плазме ингибитор активатора плзминогена, образует комплекс с избытком урокиназы и таким образом снижает образование плазмина из плазминогнеа. Материал для исследования. Неразведенная цитратная плазма. Ход определения. Используя калибраторы, строят рабочий график для определения ингибитора активатор аплазминогена. Для каждого определения необходим контроль. Содержимое переносят в кювету и калориметрируют при при длине волны 405 нм. Оценка результатов. Рассчитывают разниуц оптической плотности. По калибровочной кривой определяют содержание ингибитора активатора плазминогена. Нормальные показатели. Не более 10AU/мл Клиническое значение. Уровень повышается при беременности. Уменьшается после родов, увеличивается так же при тромбозе, инфаркте миокарда, септическом шоке, послеоперационномпериоде, других патологических состояниях.

Для оценки антитромбогенной функции эндотелия используют комплексное определение антиагрегационной, антикоагулянтной и фибринолитической активности стенки сосуда с созданием временной окклюзии локтевой вены.

А. Определение антиагрегационной активности эндотелия сосудов (Балуда В.П, с соавт. 1983г.) Для исследования в шприц, содержащий цитрат натрия берут кровь из локтевойвены, затем создают кратковременную ишемию локтевой вены, на второй руке путем наложения на нее манжетки – сфигмоманометра и повышения давления в манжетке на 10 мм. Выше систолического. Повторно кровь забирают из вены второй руки через 3 минуты. Суммарно антиагрегационная активность стенки сосудов выражается индексом, который равен частному от деления показателей агрегации тромбоцитов, до ишемии на показатель агрегации тромбоцитов после ишемии. У здоровых людей этот показатель равен 1,3 -1,8 у.е.

Б. Определение антикоагулянтной активности стенки сосудов (Балуда В.П.с соавт. 1988 г). Забор крови производится так же как при определении антиагрегационной активности стенки сосудов. Антикоагулянтная активность стенки сосудов выражается индексом, который определяется как частное от определения активности антитромбина 111в плазме крови после наложения манжеты на активность антитромбина 111, до наложения манжеты. У здоровых людей показатель составляет не менее 1,3 усл. Ед.

В. Определение фибринолитической активности сосудов. (Ойвин И.А., Чикалина С.И., 1964г). Забор крови производится так же, как при определении антитагрегационной активности сосудов. Фибринолитическая активность стенки сосудов выражается индексом, который определяется как частное от показателя фибринолитической активности крови после проведения манжеточной пробы на показатель фибринолитической активности крови до проведения манжеточной пробы.У здоровых показатель равен 1,7 усл.ед. Определение концентрации эндотелиина -1. Методы исследования: радиоиммунный, иммуноферментный. Радиоиммунный метод определения эндотелиина 1 в сыворотке крови проводится с помощью стандарных наборов компании «Phoenix Pharmaceutical Inc.. RIA 1217 (ЛКБ, Швеция), R&D System (Великобритания) Концентриация эндотелиина 1 в плазме крови определяют при помощи иммуноферментных тест систем разных фирм.