Условия взятия и доставки биологического материала в лабораторию.
Наиболее распространенным материалом для клинико-лабораторных исследований являются кровь, моча и некоторые др биологические жидкости.
Кровь берут утром натощак (между 8 и 10 часами), до физ нагрузки и проведения диагност процедур. За сутки до взятия крови исключ алкоголь, после 2 ч ночи исключить курение, прием пищи и жидкости, если для выполнения большинства тестов взятие крови производят после 8-12 ч голодания, то для определения триацилглицеринов требуется выдержать 10-12 часовой интервал после приема пищи.
Следует помнить, что при пребывании человека в течение нескольких часов в горизонтальном положении объем плазмы в русле крови оказывается на 10-15% больше, чем у пациента, сохраняющего обычный двигательный режим. Отсюда концентрация веществ в крови человека, лежавшего в течении более часа, всегда ниже, чем у него же после ходьбы. Положение тела оказывает влияние на концентрацию общего белка, альбумина, креатина, холестерола, триацилглицеринов, активность ЩФ, АСТ и др компонентов плазмы.
При взятии крови из вены время сдавления сосудов жгутом по возможности должно быть минимальным. Больному не следует сжимать и разжимать пальцы, так как это вызывает местный стаз и гипоксию, а также всдвиги в распределении некоторых веществ ( холестерола, калия, натрия, кальция и др) между форменными элементами крови и ее жидкой частью. Кровь берут из крупной вены (локтевая) в чистую сухую стеклянную или пластиковую пробирку. Что м. привести к гемолизу – узкий жиаметр иглы, длительный забор крови, интенсивное давление на поршень шприца при выливании крови в пробирку, интенсивное встряхивание и.т.д. Если пациенту проводилась в/в терапия, то кровь берут дальше от места инфуци (из вены другой руки).
При исследовании системы гемостаза к процессу взятия крови предъявляют особые требования, так, рекомендуется использовать иглу с широким просветом, лучше без шприца (его применяют для взятия крови у детей, у больных в терминальном состоянии). Чтобы исключить влияние на коагуляцию последствий венозного застоя крови, рекомендуют в процессе ее взятия на непродолжительное время (2-3 с) расслабить жгут. Кровь должна стекать по стенке пробирки. Если требуется получить плазму, в пробирку заранее вливают соотв антикоагулянт (лимоннокислый натрий, щавелевокислый натрий или калий) для предохранения крови от свертывания, кровь с антикоагулянтом осторожно перемешивают (без вспенивания), закрывают пробирку полиэтил пленкой и оставляют в штативе на 20-25 мин. При изучении системы гемостаза кровь обычно стабилизируют лимоннокислым натрием, поскольку в цитратной крови (плазме) лучше сохраняются лабильные факторы свертывания и тромбоциты.
При лизисе сосредоточенных в сгустке эр находящиеся в них ферменты переходят в сыворотку крови, этим объясняется более высокая активность энзимов (ЛДГ, АСТ, АЛТ, КФ, содержащихся в значительных количествах в тромбоцитах и эр и освобождающихся из них при свертывании крови) в сыворотке, чем в плазме, поэтому для опред этих ферментов лучше использовать плазму.
Для получения сыворотки антикоагулянт не добавляют. Доставленные пробирки закрытые ватной пробкой, помещают в термостат на 10-15 мин для прогревания, затем осторожно проводят проволокой по внутренней стенке пробирки, чтобы ускорить получение сыворотки, затем центрифугируем.. Пробирку с кровью допускается выдерживать при комнатной темпер в течении 1-1,5 ч после взятия. Снимать плазму (сыворотку)не позже 1 часа. Если сыворотка нужна немедленно, то кровь центрифугируют 15 мин при 1500 об, затем сыворотку в центрифужку и вновь центриф 10 мин.
Для постановки микрометодов кровь берут из пальца, заполняя ею специальные микропробирки, после свертывания сгусток отделяют от стенок тонким запаянным стекл капи лляром и центрифугируют в теч 20 мин.
Биохимические исследования выполняют как с плазмой, так и с сывороткой крови. Основным биолог материалом для исследования активности ферментов является сыворотка. Для электрофореза – сыворотка, гормоны – плазма, глюкоза, мочевина – можно в цельной крови. Содержание электролитов правильнее определять в плазме , поскольку конц ионов калия в эр намного превышает уровень этого катиона в плазме, они способны выходить из эр даже через неповрежденную оболочку. Определять уровень калия в плазме следует не позднее чем через ¾-1 часа после взятия крови.
Если для исследования одновременно нужны и форменные элементы крови и плазма (определение активности ацетилхолинэстеразы эр и холинэстеразы плазмы), то при взятии крови принимаются меры к предупреждению ее свертывания, в пробирки предварительно вносят раствор лимоннокислого натрия и после полного испарения водной фазы набирают в них кровь. Затем кровь центрифугируют в течение 5 мин при 3000 об, после плазму отсасывают, а эр отмывают изот раствором и несколько раз центриф, каждый раз отсасывая надосад жидкость.
Гемолизированные сыворотку и плазму не рекомендется использовать для анализа (можно гемолизаты крови применять для опред содерж глюкозы, активности фруктозомонофосфатальдолазы).
Обычно сыворотку крови содержат в холодильнике при 0-4 С, допускается ее хранение в течении месяца, если ее заморозить сразу после взятия. Активность ЩФ более стабильна при комнатной температуре. КФ определять только в свежей сыворотке.
При хранеии мочи в ней прежде всего изменяется содержание тех соединений, на которые влияют присутствующие в жидкости бактерии. Поэтому необходито производить консервацию мочи разработанными для этого способами: ♠Быстрое замораживание мочи при температуре –20 С. ♠ Добавление к сут объему мочи 5 мл раствора тимола и изопропаноле (100 г/л), моча пригодна для выполнения большинства биохим анализов, за искл определ желчных кислот. ♠ Добавление в качестве консерванта соляной кислоты 50 мл 10 моль/л раствора на суточное количество мочи ( в такой моче определяют содержание стероидов и катехоламинов) ♠Для подкисления используют также борную кислоту (1,8 г на 100 мл мочи) ♠Другие консерванты – жидкость Мюллера (10гр натрия сульфата, 25 г калия бихромата на 100 мл мочи), хлороформная вода. Для бактериологич анализа – исследование надо проводить в течении 30 мин до 1,5ч после ее выделения, если это невозможно, мочу следует подкислить и хранить в холодильнике при 4 С.
Выпотные жидкости собирают в чистую сухую колбу, содержащую в качестве антикоагулянта гепарин или лимоннокислый натрий (добавляется из расчета 1 г на 1 л жидкости), и после тщательного размешивания тотчас направляют на исследование
Биохим анализ пунктатов тканей, с этой целью ткани измельчают в соотв объеме жидкости, приготовляя из нее гомогенат или экстракт – вытяжку, для получения гомогенатов используют растворы следующего состава 0,25 моль/л сахарозы. Есть два типа гомогенатов: с разрушенными и неразрушенными клеточными органелами. Для приготовления первого типа гомогенатов – жесткие методы гомогенизации (ступки с кварц песком), для второго типа – стеклянные гомогенизаторов с тефлоновыми пестиками типа Поттера и Даунса.
Мочу– собирают всю утреннюю порцию, после тщательного туалета наружных половых органов, в чистую, сухую лаб посуду, хранить до исследования не более 1,5 часов в хол месте.
Кал- исследуют не позднее 8-12 часов после выделения, а до этого хранить при 3-5 С. Собирать в чистую, сухую посуду (желательно стекло), нужно избегать примеси мочи, выделяемого половых органов, др веществ, лекарств
Желудочная секреция – получение чистого желудочного сока, максимально достоверное изучение работы желез желудка в различные периоды секреторного цикла. Нужно применять адекватный цели стимулятор жел секреции.
Мокрота – свежевыделенную мокроту собирают в чистую сухую посуду (широкогорлая банка), должна быть мокрота при кашле, рот прополоскать кипяченой водой, желательно сразу исследовать. Наиболее достоверно исследовать содержание трахеи и бронх дерева (бронхоскопия).
Выпоты (транссудаты и экссудаты) – скапливаются в серозных полостях (плевральной, брюшной, полости перикарда), пунктируют -----в чистую сухую посуду, добавл цитрат натрия (1 г на 1 л жидкости) или гепарин ----- в лабораторию.
Доставка в специальных контейнерах для транспортировки биологического материала
10. Аналитическая надежность метода (специфичность, чувствительность, воспроизводимость, правильность). Калибровочные материалы. Референтные величины лабораторных показателей.
Основной формой контроля всех видов исследований практических лабораторий является внутрилабораторный контроль качества. Он д.б. ежедневным, объективным, и охватывать как нормальные так и патологические результаты. Наиболее объективный критерий надежности работы лаборатории дает систематический контроль. Надежность результатов исследования м. охарактеризовать след критериями: *правильности; *точность; *чувствительность; *специфичность; *диагностическая значимость.
Специфичность метода – его способность выявлять именно тот компонент, для ктр данный способ исследования предназначается. Т.е. свойство метода качественно и количественно обнаруживать одно и то же вещество. Точность – качество измерений, отражающее близость полученных результатов содержания анализируемого вещества к его истинному значению. Сходимость (воспроизводимость в серии) дает представление о близости друг к другу результатов, полученных при выполнении лабораторно-аналитических исследований пробы в различных условиях. Воспроизводимость характеризует близость друг к другу результатов, полученных при выполнении лабораторно-аналитических исследований пробы в различных условиях, это критерий отображающий степень разброса данных. Правильность – понятие, характеризующее качество измерений. Чувствительность – способность метода выявлять наименьшее количество анализируемого вещества, ктр еще м. определить, т.е. отличит от нуля.
Ответственность за качество работы несут все, начиная от персонала, моющего посуду и персонала, производящего забор материала на исследование, до заведующего лаборатории. Внутрилабораторный КК включает определение ВОСПРОИЗВОДИМОСТИ И ПРАВИЛЬНОСТИ исследований. Контроль м. осуществляться с помощью способов, использующих специальные контрольные материалы или средства и ряда способов, не требующих контрольных материалов. Контрольный материал – контрольные сыворотки, ктр м.б. стандартными, эталонными, контрольными, калибраторами. Воспроизводимость характеризует близость друг к другу результатов, полученных при выполнении лабораторно-аналитических исследований пробы в различных условиях (обычно во времени, месте).
В более широком смысле воспроизводимость — это критерий, отражающий степень разброса данных. Используется для выявления случайных ошибок.
КОНТРОЛЬ ВОСПРОИЗВОДИМОСТИ: 4 этапа – 1) определение концентрации вещества в сыворотке и установления расчетных параметров для дальнейшего КК (предпериод контроля); 2) статистическая обработка полученных данных; 3) построение контрольных карт; 4) оценка контрольных карт по предупредительным и контрольным материалам.
1-й этап- это система накопления результатов исследований контрольной сыворотки на воспроизводимость. Набор результатов контрольного материала на воспроизводимость проводится в течении 23-25 дней. Из 2 параллельных проб контрольной сыворотки вычисляют среднюю величину каждого параметра, записывают в виде столбика (Х).
2-й. если какая либо величина Х выходит далеко за пределы ряда показателей, то она отбрасывается и число дней исследования (n) уменьшается. Затем определяют отклонение от ср вел-ны результатов каждого дня исследования без учета знака. Все отклонения от средней величины суммируют ∑(Хср-Х)2 и находят среднее квадратическое отклонение (S0 по формуле: S=±√∑(Хср-Х)2/n-1, кот показывает разброс результатов от средней величины. Пределом минимального разброса результатов (предел достоверности) допускают ±2S от средней величины. Коэффициент вариации (V) для большинства биохимических исследований не д. превышать 4-5% для исследования активности ферментов 7-10%. Коэффициент вариации используется для оценки результатов исследований, выполненных одним или разными методами, сравнения методов исследования, разных измерительных приборов, оценки результатов, выполненных в разных лабораториях.
3-й откладывают Хср и отклонения от средней в пределах ±2S
4-й. результаты последующих исследований контрольного материала д. распределятся с одинаковой частотой на каждой стороне от линии средней арифметической и находится в пределах ±2S от средней. Контрольную карту оценивают по предупредительным и контрольным критериям, ориентируясь на ктр м. обнаружить ошибки в работе лаборатории.
ПРЕДУПРЕДИТЕЛЬНЫЕ КРИТЕРИИ: * 6 рез-тов наход подряд на одну сторону от средней; * 3 рез-та подряд распол за предел одного среднеквадрат отклонения ±1S; *1 рез-т наход за пред ±2S; * 6 рез-тов им-т тенд-ию наклона рез-тов в одну сторону от средней. При наличии предупр критериев следует проверить качество калибровочных или стандартных растворов, качество реактивов и сроки их приготовления, работу измерительных приборов. КОНТРОЛЬНЫЕ КРИТЕРИИ: *8 рез подряд находятся по одну сторону от средней арифметической величины; *. 5 рез подряд распол за ±1S; * 3 рез выход за ±2S; *. 1 рез распол-ся за ±3S. Рез-ты под сомнением, до исправления недостатков результаты анализа не выдавать.
КОНТРОЛЬ ПРАВИЛЬНОСТИ.
Правильность — понятие, характеризующее качество измерений. Правильность лабораторного теста оценивается соответствием определяемого результата истинному его значению. Чем оно больше, тем ближе к нулю систематические погрешности в результате анализа. Критерий правильности используется для того, чтобы показать, насколько полученные данным методом результаты отличаются от истинных.
Правильность тестов, выполняемых в клинико-диагностической лаборатории, стремятся сделать максимально большей, что достигается калибровкой лабораторного оборудования и использование референтного материала.
Контроль правильности. Использование того метода исследования, ктр указан в аннотации к контрольному материалу. Контролю подвер-ся как Н так и Р материалы. Если полученные рез-ты укладываются в пределы допустимых отклонений, то правильность удовлетворительная.
Оценка правильности рез-тов исследо-я возможна с использованием статистического критерия Лорда (L). Для этих целей опрел-т 10-20 параллельн проб контрольного материала, вычисляют среднюю арифм вел-ну, а затем сравнивают со средней величиной, указанной для контрольного материала (µ). L=(Хср-µ)/(Хмак-Хмин). Статистически установлено, что различие недостоверно при L-0,23 или меньше этой величины. Статистическая достоверность рез-тов иссле-я также определ-ся при помощи критерия Стьюдента. T=(Х1-Х2)/√S2Х2+S2Х3, SХср=S/√n