Особенности заливки в парафин крупных объектов

Заливка гистологического материала

ЗАЛИВОЧНЫЕ СРЕДЫ

Для получения тонких (до 6 мкм) гистологических срезов необ­ходимо фиксированный и промытый материал залить в плот­ную среду, предварительно пропитав ею кусочки тканей. В за­висимости от способа растворения все заливочные среды разде­ляют на растворимые в органических растворителях и водорас­творимые. К первым относятся парафин, пластические полиме­ры на основе парафина, целлоидин, ко вторым — желатин, полиэтиленгликоли, полиэфиры, некоторые метакрилаты и т.д.

Заливка ткани в парафин

Парафин — смесь высокомолекулярных предельных углеводо­родов, продукт перегонки нефти; растворяется в анилине, бен­золе, бергамотном масле, целлозольве, хлороформе, декалине, диоксане, бутаноле, пропаноле, толуоле, трихлорэтилене, кси­лоле. Каждый из этих растворителей можно использовать в ка­честве промежуточной среды между спиртом и парафином. Тем­пература плавления различных парафинов от 27 до 62 °С. В гистологической технике применяют парафин с температурой плавления 56 °С. Зарубежные фирмы производят специальный парафин для гистологических исследований, содержащий раз­личные пластические полимеры, такие как диметилсульфоксид. Их коммерческие названия «Парапласт», «Парапласт плюс», «Гистопласт С», «Гистозес».

Важнейшим условием успешной заливки материала является своевременная смена реактивов в процессе их загрязнения, а также соблюдение рекомендуемых временных и температурных параметров. Кроме того, нужно стремиться к тому, чтобы одновременно заливать одинаковые по толщине и плотности кусочки ткани.

	Схема Меркулова	Схема Волковой—Елецкого
Фиксация:	формалин 10 % 24 ч спирт-формол 24 ч жидкость Карнуа 2 – 4 ч спирт 96-100% 2 – 24 ч промывание в проточной воде 12 - 24 ч
Обезвоживание:	спирт 96 % I 24 ч спирт 96 %II 2 ч спирт 100 % I 24 ч спирт 100 % II 2 ч	спирт 50% 2 - 4 ч спирт 60 % 2 - 4ч спирт70% 12 - 24ч спирт 96 %I 12 ч спирт 96 % II 12 ч спирт 100 % I 1-12 ч спирт 100 % II 12 ч
Заливка в парафин:	спирт+хлороформ(1:1) 6-12ч или спнрт+ксилол(1:1) 1-3ч или хлороформ 6-12ч или ксилол 1-6ч хлороформ+парафин (1:1 — «каша») 37 "С 2-3ч или ксилол+парафин (1:1 — «каша») 37°С 1-2ч napaфин I 56 °С 2ч парафин II 56 °С 1ч	спирт 100 % + хлороформ(1:1) 2-3ч хлороформ I 1,5ч хлороформ II 0,5ч хлороформ III 0,5ч хлороформ+парафин (1:1) 37°С 3-6ч хлороформ+парафин (1:1) 56°С 0,5-1ч парафин I 56°С 2ч парафин II 56°С 2ч парафин III 56°С 1ч

Другие способы заливки.

Заливка по Ромейсу ручным способом 1 вариант	Заливка по Ромейсу ручным способом 2 вариант	Заливка в парапласт с помощью автомата	Заливка в парапласт с помощью вакуум-автомата.	Быстрая заливка в парапласт с помощью автомата
Фиксация 10% формалин 12ч	10% формалин 12ч	Фиксация в 5 % формалине 2ч		Фиксация в 5 % формалине при 60°С 10мин
Промывание в проточной воде 2ч	Промывание в проточной воде 2ч	Спирт 70 % I 2ч	Спирт 70 % I 5 мин	Ацетон I 30мин
50% спирт 2ч	50% изопропиловый спирт 2ч	Спирт 70 % II 1ч	Спирт 70 % II 12мин	Ацетон II 30мин
75% спирт 3ч	75% 3ч	Спирт 96 % I 1ч	Спирт 96 % I 12мин	Ацетон III 30мин
96% 4ч	90% 6ч	Спирт 96 % II 1ч	Спирт 96 % II 12мин	Ацетон IV 30мин
100% I 4ч	100% Изопропиловый спирт I 4ч	Спирт 100 % I 1ч	Спирт 100 % I 12 мин
100% II 4ч	100% II 4ч	Спирт 100 % II 1ч	Спирт 100 "оII 12мин
Метилбензоат I 2ч	Изопропиловый спирт+парафин (1:1) 60*С 12ч	Спирт 100 % III 1ч	Спирт 100 "оIII 12мин
Метилбензоат II 2ч	Хлороформ I (бензол) 1ч	Бензол I 15мин	Ацетон-ксилол (1:1) 10мин
Бензол 2ч		Хлороформ II (бензол) 1ч	Бензол II 15мин	Ксилол 10мин
Бензол+парафин(1:!) 1ч	Парапласт I 60 °С 2ч	Парапласт плюс I 60°С 15мин
Парафин 60*С 8ч	Парафин 60*С 8ч	Парапласт П 60 'С 3ч	Парапласт плюс II 60°С 25мин	Парапласт плюс 60°С 30мин
Всего 47ч	Всего 54ч	17ч	12 ч 27 мин	3 ч

Наиболее быстрым, простым, не требующим применения специальной аппаратуры методом заливки материала является способ, разработанный И. И. Золотых в патологоанатомическом отделении Института хирургии им. А. В. Вишневского.

96 % спирте 15 мин

100 % Спирт 15 мин

Хлороформ 15 мин

Хлороформ-парафин при 56 °С15 мин

Парафин при 56 °С, энергично встряхивая 1 мин

Парафин при 56 °С 45 мин

Продолжительность 2 ч 30 мин

У насзаливка проходит следующим образом:

Формалин 10% 24 часа

Промывка проточной водой 1 час

спирт 70% (обезвоживание) больше 4 часов

спирт 80% больше 4 часов

спирт 96% больше 4 часов

спирт+хлороформ 1:1 до 1 часа(пересушивается)

хлороформ чистый до 1 часа

хлороформ чистый до 1 часа

хлороформ+парафин 1:1 37С до 1 часа

парафин 1 56С 45 м

парафин 2 56С 45 м

в блоки.

Для приготовления препаратов следует:

ксилол 1 (депарафинизация) 56С 10 м

ксилол 2 56С 10 м

фильтровальная бумага(промокашка)

спирт 96% 5 м

спирт 70% 5 м

фильтровальная бумага

гематоксилин 5 м

промываем дистиллированной водой

эозин до 2 м

вода водопроводная

спирт макнуть

фильтровальная бумага

ксилол 56С больше 10 м (для просветления)

Особенности заливки в парафин крупных объектов

Заливка в парафин позволяет получать гистологические срезы больших размеров (гистотопографические срезы), например срезы всего органа (матка, почка) или его значительной части (доля легкого). Заливку проводят вручную, и для нее требуется дополнительное время на всех этапах. Для приготовления таких срезов из ткани головного мозга с помощью мозгового ножа де­лают срез свежей ткани толщиной около 1 см и закладывают в ванну с фиксатором. Для того чтобы сохранить плоскую конфи­гурацию среза, его кладут между двумя проволочными сетками, которые притягивают друг к другу резиновыми кольцами. Про­должительность фиксации 48 ч. После промывки в проточной воде (3—4 ч) следует обезвоживание в 70 %, 96 % и 100 % спир­те (по 2 смены) в течение 48 ч. Для обезвоживания можно при­менить изопропиловый спирт, обеспечивая частую его смену и температуру 45 °С (в термостате). Это позволяет избежать по­лучения чрезмерно жестких препаратов. В качестве промежу­точной среды используют метилбензоат или хлороформ — 3 смены по 3 дня. Объекты заливают в парафин или парапласт, имеющие температуру плавления 56—58 °С.