Получение поликлональных антител

Процесс получения поликлональных антител можно разделить на несколько этапов. На первом этапе проводится иммунизация животного. При проведении иммунизации необходимо учитывать ряд особенностей, чтобы получить высококачественные антитела.

Большое значение имеет иммуногенность антигена – способность антигена вызывать в организме иммунизированного животного образование антител. Не каждое вещество обладающее антигенными свойствами в одинаковой степени будет стимулировать синтез антител. Иммуногенность антигена зависит от различных факторов:

- от молекулярной массы антигена. Высокомолекулярные вещества по сравнению с низкомолекулярными обладают большей иммуногенностью. Это может быть связано с увеличением количества антигенных детерминант, что повышает эффективность взаимодействия антигена с иммунными клетками.

- от времени пребывания антигена в организме.

- от уровня “чужеродности” антигена. Как правило, чем сильнее структура антигена отличается от структур веществ организма, тем выше его иммуногенность.

Качество получаемых антител зависит от гомогенности (чистоты) вводимого антигена. Это обусловлено тем, что примеси также могут обладать иммуногенностью, а в некоторых случаях даже большей, чем основной антиген.

Еще один фактор, который необходимо учитывать при проведении иммунизации – это количество вводимого антигена. Слишком высокие или слишком низкие концентрации антигена могут часто не способны тормозить механизмы гуморального иммунитета. Поэтому в каждом конкретном случае необходимо подбирать оптимальную дозу антигена.

Исходя из того, что образование антител является компонентом гуморального иммунитета, необходимо учитывать способ и периодичность введения антигена. Иммунный ответ в организме развивается постепенно. После первого попадания антигена в организм развивается первичный ответ, затем после последующих введений – вторичный ответ (рис. 3).

Рисунок 3. Иммунизация и иммунный ответ.

Состав антител в разные стадии иммунного ответа может сильно варьировать. Наибольшей эффективности удается добиться при проведении нескольких циклов иммунизации введением небольших порций антигена в различные точки. Основные места введения антигена:

- внутрикожное введение – на участке кожи удаляют шерсть, делают несколько царапин и втирают раствор антигена. Этот способ позволяет получать высокий иммунный ответ уже после первого введения антигена.

- подкожное введение – вводят несколько доз антигена вдоль позвоночника животного.

- внутримышечное введение – вводят антиген небольшими порциями в мышцы задних лап.

- внутрибрюшинное введение

- введение в лимфатические узлы

- внутривенное введение – этот способ часто используют при проведении повторных инъекций с отбором крови.

Часто введение антигена проводят в комплексе с адъювантом. Адъюванты – вещества способные вызывать неспецифическое усиление иммунного ответа (примеры таких веществ: липосомы, полимеры, клеточные мембраны бактерий и др.). Введение адъювантов снижает возможность развития толерантности, способствует более медленному высвобождению антигена из участка инъекции, снижая его токсичность, стимулирует местную воспалительную реакцию. При внутривенной иммунизации адъювант не используют, так как в этом случае он может привести к гибели животного.

В ходе иммунизации производят оценку количества антител. Как правило, при введении растворимого антигена максимальная концентрация антител возникает через 40-60 дней, и 12-20 дней, если иммунизация проводилась клетками микроорганизмов. После достижения максимальной концентрации антител у иммунизированного животного отбирают некоторое количество крови (в зависимости от вида, одно животное можно использовать в качестве донора от 3 до 7 месяцев, проводя повторные циклы иммунизации). Из отобранной крови удаляют форменные элементы, фибриноген, полученную сыворотку прогревают при 56°С для инактивации системы комплемента. После этого иммунная сыворотка готова к применению. Для длительного хранения полученную иммунную сыворотку рекомендуется хранить в лиофилизированном состоянии. Для увеличения относительного количества антител из иммунной сыворотки выделяют γ-глобулиновую или Ig-G фракцию методом осаждения с последующим диализом ( в качестве осадителя используется полиэтиленгликоль или сульфат аммония) или при помощи ионообменной хроматографии.