Oligonukleotide для гены цитрата и лактозы веществ

В табл. 10 и Tab. 11 перечисленных Oligonukleotide были в 2.4.2

описанные программ с учетом тех же параметров разработана. При их

Выбор здесь тоже была уже на Пригодность для последующей гибридизации на

ДНК-микро-массив уважение.

Primer-

Название

Ген цели/

АКК. nr.

Последовательность (5‘-3‘)

ВР тм

Поз.

Prod

Длина

CitPermAllFLit цитрат-Permease GGAGTTGGTGCTGGTATTGTG

21 52,0 795-814 595

CitPermAllF L29572/U28212 TTTCAACAAAGACGCTGCCAA

21 55,8 370-390

CitPermAllR M58694/S77101 CAACCGGATACAATCCAAACAAC

23 54,9 1367-

CitPermLeuF цитрат-Permease ATTAATTGTGACTGGAGAACGGTCT 25 54,3 19-43

CitPermLeuR L29572/U28212 TTTGCGTTGGATAAAATCCAGC

22 55,8 164-185

CitPermLacF цитрат-Permease CTGGAGAACGGTCTCCAATCT

21 52,3 33-53

CitPermLacR M58694/S77101 TAGTTTGTGTTGAATAAAATTCCAT 25 49,2 175-199

АЛЬ-SynthAllF α-Acetolactat-

Синтазы

CCTGTCGTTGAAACATTCCAAGGT 24 55,7 1925-

АЛЬ-SynthAllR A23961/I12060/

L16975/X93091/

AF035772

CAAACGTACAGCTGTTTCCAATTC 24 54,0 2582-

Page 38

2. Материал и методы

_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

АЛЬ-

DecarbAllF

α-Acetolactat-

Декарбоксилаза

GGGACAATTGTTGGTATTTGGAC

23 53,5 528-550

АЛЬ-

DecarbAllR

A37903/S82499/

U92974/X82620

GGTCAATTGCGCCAATTTCAACA

23 53,5 659-681

PflAllF

Пируват-Формиат-

Лиазы

TGCAGAACGTGACCTTGCTCG

21 56,3 2298-

PflAllR

AJ000325/

AJ000326

GGGTTAGCACCTGGTGAGAAGAA 23 57,0 3373-

Tab. 10. Праймеры для детекции генов в цитрат удаления.

Primer-

Название

Ген цели

Последовательность (5‘-3‘)

ВР тм

Поз.

Prod.

Длина

L-LDHF

Лактат-Dehy-

снадобье нос

GGAGATGCAGAAGACCTTTCTC

22 54,8 474-

L-LDHR

L07920/

U02385/

M88490/

M95919/

U04315 и др.

GGTAGTCATTTTCTTGGAACCATT 24 52,3 934-

D-LDHF

Лактат-Dehy-

снадобье нос

TTGGACTATACACGTGAAACATTGA 25 52,8 613-

D-LDHR

L29327

ATTAGATGATGGTTTTCAGGTACAC 25 52,8 1079-

LacPermLacF Лактозы

Permease

TGGGGAACTAAAGAACAAAAATCA 24 50,6 643-

LacPermLacR U60828/

AJ011653

AAGCGTTACGGCTTCATTAC

20 49,8 1112-

LacPermLeuF Лактозы

Permease

CCGGTCACCACATACTTCACT

21 51,3 559-

LacPermLeuR U47655

TCCGGATCAATAGCAAAACC

20 51,7 1546-

Tab. 11. Грунтовка для лактозы импорта и лактат-синтез.

Oligonukleotide для выявления Lactococcus-фаги

В Табл. 12 пар Праймеров для выявления трех у Lactococcus происходя

Фаги вида 936, P335 и c2 в списке. Основываясь на трассы, которые в табл. 3

перечисленные последовательность записи отдельных представителей фаги из вида

Базы данных охватывали, были заложены в грунт залуживал области. Чтобы

Для повышения чувствительности ПЦР, была создана для вида 936 "Nested PCR".

Грунтовка пары M936_X1, P335_X и C2_X были из литературы (Labrie и

Page 39

2. Материал и методы

_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Moineau, 2000) взяты. В настоящее время на основе доступных последовательность информации

Primer были созданы, один для идентификации типичных производственное предприятие

Фаги P482 позволить. Подбор праймеров и их хранение осуществлялось как в 2.4.2

описано.

Primer-

Название

Цель

Последовательность (5-3)

ВР

ТМ

Prod.

Длина

P936all_F2out

P936

CGCGTGCTTAACTGGATG

49,9

P936all_R2out

P936

CCAATAAGAGGTAAAGCCATAGTC

50,6

P936all_F2nest

P936

GAAGCAAGCGATACATTAAGAGTGT

53,2

P936all_R2nest

P936

CATGTAAAGTAAACCGAACGACCTA

53,7

M936_F1

P936

TCAATGGAAGACCAAGCGGA

51,8

M936_R1

P936

GTAGGAGACCAACCCAAGCC

54,8

P482c18_Fout

P482

TAGAGGCTTGGGATAACATAA

46,4

P482c18_Rout

P482

CTGCGATAAGAAGTCTACAAAAC

47,8

P482c9_Fout

P482

CGTCAGCGCGTCATACAA

51,2

P482c9_Rout

P482

AGCTAGAACGGAAGTCAGAGAAGT

51,9

P335_F

P335

GAAGCTAGGCGAATCAGTAA

49,8

P335_R

P335

GATTGCCATTTGCGCTCTGA

51,8

C2_F

С2

CAGGTGTAAAAGTTCGAGAACT

51,1

C2_R

С2

CAGATAATGCACCTGAATCA

49,7

Tab. 12. Primer пар, подтверждающие различные фаги вида или

"Дом фаги" исследуемого производственного объекта P482.

Для однозначного доказательства длинными Insert-содержащими вариант фаги были P482

два лежащих в Insert Primer P482_Ins1 и P482_Ins2 развивается вместе

с задней вставкой лежащих Primer P482_R один ВР 1400 или 2174 длительное ВР

Продукт получился (табл. 13). Вставки-свободный вариант может продукт 982 длительное ВР

с праймерами P482_V и P482_R быть обнаружены.

Primer-

Название

Последовательность (5‘-3‘)

ВР

Тм

Положение Prod.

Длина

P482_Ins1

GCAATGGCAAAGCTACC

59,0

7822-7839 1400

P482_Ins2

CTGGTTTTGTTATGATCCCTCCTA

60,0

7058-7081 2174

P482_V

AGCTTTGTCATGGGTTACTATTA

54,6

6258-6280

P482_R

TTGGATAAACGACTACACG

51,5

9252-9270

Tab. 13. Oligonukleotide для доказательства insert-содержащих insert или свободный вариант

в фаги P482.

Page 40

2. Материал и методы

_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Зондов для ДНК-чип-гибридизации

В табл. 14 представленных зонды и ПЦР-праймеров, которые в предыдущих

Исследования видов Бактерий, фаги вида, фаги и гены устойчивости

Метаболические характеристики пришли, были уже среди для совместного

Гибридизации на поверхности Чипа важных точек зрения были выбраны.

В образце узнаваемый

Молекулярные маркеры

Используемые зонды

Виды бактерий

EUB338, LGCc354_+1, LLA271, LLC68_+3,

LLL68

Фаги вида

P335_F_+1, P335_R, P936all_F1_nest,

P936all_R1_nest

Фаги гены устойчивости

Ads_R, AbiB_F, AbiB_R, AbiN_F,

RM1_hsdR_F1, RM1_hsdR_R1,

RM1_hsdR_F2, RM1_hsdR_R2,

RM2_Lla2R_R5, RM2_LlaB1R_F6,

RM2_LlaB1R_R6, RM2_LlaB2R_F7,

RM2_LlaD2R_F9

Метаболические характеристики

LacPermLac_F, АЛЬ-DecarbAll_R, PflAll_R,

L-LDH_F, L-LDH_R

Tab. 14. Зондов для ДНК-чип-гибридизации.

Только последовательность зондов LGCc354, LLC68 и P335_F было несколько

Пары оснований может быть продлен, чтобы все зонды соответствовали следующим критериям:

(1) температура плавления составляет 50 ± 2°C,

(2) отсутствие вторичных структур с ∆G-значение меньше -3,5

(3) уникальный дискриминационных доступности от ближайшей подобной последовательности не менее 2

средних Mismatches.

Зонда

Название

Последовательность (5‘-3‘)

ВР

Положение

Тм

LGCc354_+1

GCCGAAGATTCCCTACTGC

354-372

51,3

LLC68_+3

CGACTATAATGCTTAAGTCCACG

68-87

50,7

P335_F_+1

GAAGCTAGGCGAATCAGTAAA

48,7

Tab. 15. Оптимизация последовательности Зонда для использования в ДНК-чип-гибридизации.

Page 41

2. Материал и методы

_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Образец