Определение фаготипов брюшнотифозных палочек.

Фаготипирование - это определение принадлежности выделенного бактериального штамма к тому или иному фаготипу. Фаготип - это совокупность бактериальных штаммов, характеризующихся одинаковой чувствительностью к типовому набору бактериофагов. Бактериофаг - это вирус, способный инфицировать бактериальную клетку, репродуцироваться в ней и вызывать ее лизис. Фаготипирование применяется, как правило, в интересах эпидемиологического анализа - это сопоставление эпидемиологических, клинических, лабораторных и других данных применительно к определенной инфекционной болезни с целью установления причин ее распространения, определения характера и масштабов необходимых противоэпидемических мер.

Фаготипирование проводится по следующей методике. На чашки Петри засевают шпателем взвеси исследуемых культур. На засеянную поверхность агара пипетками наносят аккуратными каплями индикаторные бактериофаги различных типов. Места нанесения фагов маркируют на дне чашки. Пипетки и шпатель помещают в стакан с дезраствором. Посевы помещают в термостат на 24 часа. Через сутки учитывают результат. На поверхности выросших исследуемых культур определяют зоны лизиса бактерий соответствующим типом фага. Сравнивают фаготипы культур, выделенных из разных источников.

В данном случаев даны две культуры: выделенная от больного и из водного источника. На чашках видно, что лизис культур происходит при действии одного и того же вида фага Д5. Фаготип обеих выделенных культур - Д5, значит, выделенные культуры микроорганизмов идентичны по фаготипу больной мог заразиться при употреблении инфицированной воды.

1. Цветная проба.

Один из методов обнаружения вируса в исследуемом материале, идентификация вируса и обнаружения антител в сыворотке крови обследуемого пациента.

Общим принципиальным положением при выделении вирусов является их культивирование в живой клетке (культура ткани, куриный эмбрион, организм животного). В основе идентификации вирусов лежит принцип нейтрализации, т.е. взаимодействие вируса со специфической иммунной сывороткой, в результате которого вирус утрачивает способность проявлять свою активность в действии на субстрат (клетки культуры ткани, эритроциты, куриный эмбрион и т.п.).

Культура клеток – клетки какой-либо ткани животных или человека, способные расти и размножаться в искусственных условиях. Культуры клеток широко применяются при диагностике вирусных инфекций, в производстве вакцин, незаменимы при проведении научных исследований в области вирусологии. Для успешного получения клеточных культур и последующего размножения в них вирусов культивируемые клетки должны постоянно находиться в сбалансированной физиологической среде, содержащей все необходимые компоненты для их жизнедеятельности и размножения. Питательные потребности клеток обеспечиваются наличием незаменимых аминокислот (таких, как глутамат, лейцин, изолейцин, валин, фенилаланин, аргинин, гистидин, метионин, треонин, цистин, тирозин), витаминов (особенно комплекса В), глюкозы и сыворотки крови. Изотоничность и буферность среды поддерживается с помощью неорганических солей. Оптимальным является рН 7,2-7,4, при длительном культивировании клеток значение рН должно оставаться в пределах 6,8-7,8. Постоянство рН в течение нескольких дней обеспечивается присутствием карбонатного и фосфатного буферов. Стабилизации значения рН способствует выращивание культур в пробирках и флаконах, закрытых резиновыми пробками, вследствие чего не улетучивается СО₂ (в противном случае это привело бы к сдвигу рН в щелочную сторону). Контроль за реакцией среды осуществляется путём добавления индикатора фенолрот: при рН 6,8-7,2 среда имеет жёлтый цвет, при рН 7,2-7,4 – оранжево-розовый, при рН 7,4-7,6 – красный, при рН 7,7-7,8 – красно-фиолетовый.

Индикацию вирусов в культуре клеток проводят на основании феномена цитопатического действия (ЦПД). «Цветная» проба. Если вирусы не размножаются в культуре клеток, то живые клетки в процессе своего метаболизма выделяют кислые продукты, что ведет к изменению рН среды и цвета индикатора фенолового красного на желтый. При продукции вирусов нормальный метаболизм клеток нарушается, клетки гибнут, и среда сохраняет свой первоначальный (красный) цвет. Таким образом, красный цвет среды указывает на наличие вируса и прекращение жизнедеятельности клеток.

Для идентификации вирусов используется феномен задержки цитопатического действия (ЗЦПД). При этом можно определить соответствие вируса и вируснейтрализующей сыворотки, если их предварительно смешать и эту смесь после инкубации внести в культуру клеток. Специфическая сыворотка нейтрализует вирус, он не оказывает цитопатическое действие на клетки культуры, клетки остаются живы, изменяется рН и цвет среды становиться желтым.

Тот же феномен (ЗЦПД) лежит в основе серологических реакций. В пробирку вноситься среда 199, культура клеток и смесь вирусного диагностикума (известный АГ) и сыворотки крови обследуемого (неизвестные АТ). При соответствии АТ вирусному АГ происходит реакция нейтрализации, культура клеток остается жизнеспособной и изменяется цвет среды на желтый.

1. Реакция связывания комплемента.

Эта реакция относится к реакциям иммунитетамежду антигенами (АГ) и антителами (АТ). Детерминанта АГ связывается с активным центром АТ. Соединение АГ и АТ осуществляется посредством водородных и гидрофобных связей, взаимодействия ионов, кулоновских и ван-дер-вальсовых сил. Прочность соединения АГ с АТ обеспечивается не только силами связывания, но и оптимальной стерической адаптацией активного центра АТ к АГ-детерминанте.

Серологические реакции протекают в две фазы. Первая – специфическая невидимая, - заключается во взаимодействии АГ с АТ. Вторая фаза – видимая, - проявляется в зависимости от типа реакции, который определяется свойствами АГ, АТ и другими ингридиентами реакций. В основе РСК лежит реакция лизиса антигена (цитолиза или бактериолиза) под действием антител с участием комплемента.

Ингредиенты реакции: 3 (три) системы, 5 (пять) компонентов. Бактериологический (вирусологический) метод. Диагностическая система: антиген (первый компонент) не известен – выделенная чистая культура; антитело (второй компонент) известен – диагностическая сыворотка (содержит известные АТ, получена путем иммунизации животного известным АГ). Комплемент (вторая система, третий компонент) – получается из сыворотки крови морской свинки. Индикаторная система (здесь все известно): эритроциты барана (антиген) (четвертый компонент) и гемолитическая сыворотка (антитела, получаемся путем иммунизации кролика эритроцитами барана) (пятый компонент).

Серологический метод. Диагностическая система: антиген (первый компонент) известен – диагностикум; антитело (второй компонент) не известен –сыворотка крови обследуемого (содержит не известные АТ). Комплемент (вторая система, третий компонент) – получается из сыворотки крови морской свинки. Индикаторная система (здесь все известно): эритроциты барана (антиген) (четвертый компонент) и гемолитическая сыворотка (антитела, получаемся путем иммунизации кролика эритроцитами барана) (пятый компонент).

Система комплементапредставлена большой группой взаимодействующих между собой белков (20 белков идентифицированы иммунологически) и гликопротеидов сыворотки крови, обозначаемых символом «С», а девять основных компонентов комплемента – цифрами: С1, С2, С3, … С9. Каждый компонент расщепляется на субъединицы, обозначаемые буквами – Сlq, C3a, C3b и т.д. Вырабатываются белки комплемента макрофагами, нейтрофилами, клетками печени и составляют 5-10% всех белков сыворотки. В организме комплемент находится в неактивном состоянии и активируется рядом факторов. После активации его действие носит каскадный характер, что приводит к образованию мембраноатакующего комплекса и последующему лизису клетки мишени.

Функция системы комлемента: Лизисчужеродных клеток и бактерий; Опсонизациячужеродных клеток, включая бактерии, которые становятся более доступными для макрофагов благодаря феномену иммунного прилипания (обусловлен фиксацией С3b компонента на бактериях и наличием рецептора для С3b на макрофагах). Стимуляция хемотаксиса. Стимуляция фагоцита(обусловлена присоединением к иммунному комплексу Cq или C3b). Опосредует процесс воспаления(повышение сосудистой проницаемости – С5а, С3а; усиление выброса биологичеси активных веществ- анафилотоксинов – С5а, С3а).

Известны два основных пути активации комплемента: классический(активируется комплексом антиген-антитело – IgG, Ig M); альтернативный(индуцируется ЛПС, антигенами вирусов, грибов, простейших, иммунными комплексами с Ig A, Ig E и т.д.). С3 компонент комплементаиграет центральную роль в обоих путях активации комплемента.

Реакция основана на способности комплемента – комплексной системы белков нормальной сыворотки позвоночных, фиксироваться на комплексе АГ-АТ и последующем лизисе антигена. Самого комплемента ровно столько, чтобы он связался только с одной системой (опытной или индикаторной).

Если АГ и АТ в опытной системе соответствуют друг другу (комплементарны), то результатом этого взаимодействия является связывание комплемента. Комплемент лизирует этот комплекс и расходуется, поэтому эритроциты хоть и связываются с гемолитической сывороткой, но не могут лизироваться, так как нет комплемента и выпадают на дно пробирки в виде осадка. Таким образом, отсутствие гемолиза – положительный результат.

Индикаторная система выявляет свободный, не связавшийся комплемент. Если АГ и АТ опытной системы не соответствуют друг другу (некомплементарны) комплемент остался свободным, и он свяжется с комплексом эритроциты – гемолитическая сыворотка и будет лизировать эритроциты. Визуально видна «лаковая» кровь. Это (наличие гемолиза) означает отрицательный результат РСК.

1. Реакция Видаля.

Реакция Видаля – это реакция агглютинации, применяемая для диагностики брюшного тифа. Предложена в 1896 французским врачом Ф. Видалем (F. Widal, 1862—1929). Эта реакция относится к серологическим реакциям иммунитета между антигенами (АГ) и антителами (АТ). Детерминанта АГ связывается с активным центром АТ. Соединение АГ и АТ осуществляется посредством водородных и гидрофобных связей, взаимодействия ионов, кулоновских и ван-дер-вальсовых сил. Прочность соединения АГ с АТ обеспечивается не только силами связывания, но и оптимальной стерической адаптацией активного центра АТ к АГ-детерминанте.

Серологические реакции протекают в две фазы. Первая – специфическая невидимая, - заключается во взаимодействии АГ с АТ. Вторая фаза – видимая, - проявляется в зависимости от типа реакции, который определяется свойствами АГ, АТ и другими ингридиентами реакций.

Реакция Видаля основана на способности антител (агглютининов), образующихся в организме в течение болезни и длительно сохраняющихся после выздоровления, вызывать склеивание брюшнотифозных микроорганизмов. Если при добавлении к сыворотке крови человека культуры возбудителя происходит агглютинация, реакция считается положительной. Для диагностики брюшного тифа реакцию ставят многократно, учитывая её показания в динамике и в связи с анамнезом. Визуально при положительной реакции при встряхивании пробирки видны белые хлопья агглютинации поднимающиеся в виде змейки со дна пробирки и на прозрачном фоне жидкости эти хлопья видны отдельными частицами. При отрицательном результате встряхивание пробирки при водит в образованию равномерного помутнения жидкости.

Реакция непрямой (пассивной) гемагглютинации (РНГА).

Эта реакция относится к серологическим реакциям иммунитета между антигенами (АГ) и антителами (АТ). Детерминанта АГ связывается с активным центром АТ. Соединение АГ и АТ осуществляется посредством водородных и гидрофобных связей, взаимодействия ионов, кулоновских и ван-дер-вальсовых сил. Прочность соединения АГ с АТ обеспечивается не только силами связывания, но и оптимальной стерической адаптацией активного центра АТ к АГ-детерминанте.

Серологические реакции протекают в две фазы. Первая – специфическая невидимая, - заключается во взаимодействии АГ с АТ. Вторая фаза – видимая, - проявляется в зависимости от типа реакции, который определяется свойствами АГ, АТ и другими ингридиентами реакций.

Реакция непрямой гемагглютинации (РНГА; син. реакция пассивной гемагглютинации) - метод обнаружения и идентификации антигенов или антител, основанный на возникающем в их присутствии феномене агглютинации эритроцитов, на поверхности которых были предварительно адсорбированы соответствующие специфические антитела или антигены.

Серологический метод. Сыворотка крови обследуемого пациента (содержит неизвестные (искомые) АТ). Эритроцитарный диагностикум – содержит известный антиген, адсорбированный на поверхности эритроцита. Образование комплекса АГ-АТ влечет за собой и склеивание эритроцитов, что легко учитывать. Таким образом, эритроциты не участвуют непосредственно в образовании комплекса АГ-АТ, служат для укрупнения корпускула и соответственно являются индикаторами наличия комплекса АГ-АТ. РНГА более чувствительна, чем РА.

РНГА может использоваться как экспресс-метод, например при диагностике чумы или газовой гангрены. Ингредиенты: исследуемый материал – неизвестный АГ, диагностикум эритроцитарный антительный (содержит известные АТ адсорбированные на поверхности эритроцита). Образование комплекса АГ-АТ влечет за собой и склеивание эритроцитов, что легко учитывать.