Определение афлатоксина в пищевых продуктах

Афлатоксины–продукты жизнедеятельности микроскопических грибков Aspergillus – в естественных условиях загрязняют зерновые, бобовые и другие пищевые продукты и уже при низких концентрациях представляют серьезную угрозу для здоровья животных и человека. Поэтому задача точного и быстрого количественного определения афлатоксинов является крайне актуальной для пищевого и ветеринарного контроля.

Афлатоксины - кристаллические вещества белого цвета, они относительно стабильны к действию тепла и не разрушаются в условиях пастеризации и кулинарной обработки пищевых продуктов. Афлатоксины разлагаются под действием солнечного и УФ-света, а также щелочей и окислителей. Они хорошо растворимы в диметилсульфоксиде, ацетонитриле, ацетоне, спиртах, хлороформе и хлористом метилене, умеренно растворимы в воде (около 20 мг в 1 литре) и практически нерастворимы в гексане, диэтиловом эфире и петролейном эфире. Стандарты афлатоксинов хранят при температуре ниже 0° в виде растворов в смеси бензол-ацетонитрил (98:2) или хлороформе.

Афлатоксины могут быть обнаружены в зерновых, зернобобовых, арахисе и других орехах, семенах хлопчатника, кофе, какао, кормах сельскохозяйственных животных, а также в некоторых продуктах животного происхождения, в частности в молоке и молочных продуктах. В большинстве случаев обнаруживается наиболее токсичный из основных афлатоксинов - афлатоксин B. Афлатоксины B , G и G менее токсичны, встречаются реже и в меньших концентрациях.Большинство химических методов анализа афлатоксинов основано на измерении флуоресценции этих соединений в длинноволновом УФ-свете (максимум возбуждения 360 - 365 нм). Афлатоксины B и B обладают синей флуоресценцией (максимум эмиссии 425 нм), афлатоксины G и G - сине-зеленой флуоресценцией (максимум эмиссии 450 нм). При попадании афлатоксина B в рационы молочных коров с молоком может экскретироваться афлатоксин M1, обладающий синей флуоресценцией (максимум эмиссии 425 нм).Флуоресцентные методы анализа имеют высокую чувствительность и позволяют обнаруживать афлатоксины в пределах до 0,5 нанограмм. В то же время, эти методы недостаточно специфичны. Это связано с тем, что в экстрактах пищевых продуктов могут содержаться вещества, близкие к афлатоксинам по флуоресцентным и хроматографическим свойствам, которые могут быть ошибочно приняты за афлатоксин. В связи с этим необходимы предварительная очистка экстракта и проведение тестов, подтверждающих наличие афлатоксинов. Настоящие рекомендации предназначены для использования лабораториями санитарно-эпидемиологических станций и институтов гигиенического профиля при определении содержания афлатоксинов в различных пищевых продуктах, включая молоко и молочные продукты. Метод позволяет надежно обнаружить афлатоксины B и G на уровне 1 - 2 мкг/кг, афлатоксины B - G на уровне 0,5 - 1 мкг/кг и афлатоксин M на уровне 0,5 - 1 мкг/кг. Применение двух тестов, подтверждающих наличие афлатоксинов, повышает достоверность результатов анализа. В основе количественного определения лежит визуальное сравнение интенсивности флуоресценции пятен афлатоксинов образца с интенсивностью флуоресценции пятен стандартов афлатоксинов при двумерной тонкослойной хроматографии (ТСХ). Относительное стандартное отклонение при визуальном определении составляет 0,3 - 0,5. Продолжительность определения 3 - 3,5 часа.

Метод определения массовой доли афлатоксина М1 в молоке и продуктах его переработки основан на последовательном проведении следующих операций:

• экстракции афлатоксина М1 из образца;

• очистке экстракта методом твердофазной экстракции (ТФЭ) с использованием патрона «Диапак® С»;

• переводе афлатоксина М1 в интенсивно флуоресцирующее соединение обработкой трифтор-уксусной кислотой и определении массовой доли афлатоксина М1 в форме его производного методом обращенно-фазовой хроматографии с флуориметрическим детектированием.

Оборудование и реактивы:

• жидкостный хроматограф «ЦветЯуза-01-АА» с флуориметрическим детектором;

• хроматографическая колонка с предколонкой, заполненные обращенно-фазовым сорбентом, например, «Кромасил®С18»;

• лабораторный вакуумный насос (мембранный или водоструйный);

• устройство для перемешивания проб;

• устройство для удаления растворителя;

• концентрирующие патроны «Диапак®С»;

• центрифуга лабораторная;

• СО состава раствора афлатоксина М1 в ацетонитриле;

• натрия хлорид, х.ч.;

• натрия сульфат, безводный, х.ч.;

• ацетон, х.ч.;

• ацетонитрил для жидкостной хроматографии, ос.ч.;

• гексан, ч.д.а.;

• изопропанол (ИПС), ч.д.а.;

• хлороформ,ч.д.а.;

• кислота лимонная, 1-водная,ос.ч.;

• кислота трифторуксусная, имп.

Сбор, обработку и вывод данных осуществляют с помощью персонального компьютера c операционной системой «Windows®98/ME/NT/2000/XP», на котором установлена программа сбора и обработки хроматографических данных «МультиХром® для Windows®».

Молоко нагревают в термостате до 35⁰С, чтобы растворить слой жира для получения хорошей гомогенизации пробы для анализа при умеренном перемешивании.

Гомогенизированную пробу для анализа центрифугируют при радиальном ускорении 2000 g не менее 15 мин. Пробу охлаждают для лучшего отделения жира и верхний тонкий слой жира удаляют. При необходимости проводят фильтрование через один или более листов фильтровальной бумаги. Собирают не менее 100 см³ приготовленной таким образом пробы для анализа.

Проведение анализа

На пластину тонкослойной хроматографии наносят 10-20 мм³ очищенной пробы. Добавляют аликвоты, например, по 5, 10, 20 мм³ соответствующего рабочего стандартного раствора афлатоксина М1 (ГОСТ Р 52831-2007).

Пластинку помещают в камеру для тонкослойной хроматографии, содержащую раствор для однонаправленной тонкослойной хроматографии. Хроматографию проводят до тех пор, пока фронт растворителя не достигент высоты примерно 10 см.

Удаляют пластинку из камеры и оставляют ее сохнуть на воздухе. Считывают полученные пятна, используя ультрафиолетовую лампу или денситометр при 365 нм. Сравнивают интенсивность флуоресценции пятна на хроматограмме пробы с интенсивностями, полученными для рабочих стандартных растворов афлатоксина М1.

Вычисляют содержание афлатоксина в анализируемой пробе.

Если интенсивность флуоресценции пятна на хроматограмме пробы выше по сравнению с рабочим стандартным раствором афлатоксина М1 самой высокой интенсивности флуоресценции, то оценивают уровень загрязнений. Исходя из этого уровня, разбавляют очищенную пробу для анализа подходящим объемом смеси толуол/ацетонитрил (ГОСТ Р 52831-2007).

Обработка результатов

Вычисляют массовую концентрацию или массовую долю афлатоксина М1 в пробе, мкг/дм³ или мкг/кг, используя следующее уравнение:

где Vs – численное значение объема рабочего стандартного раствора А или В, сравнимое с объемом анализируемой пробы и используемое в вычислении, мм³;

Сs - массовая концентрация афлатоксина М» используемого рабочего стандартного раствора А или В, сравнивая с объемом анализируемой пробы и используемая в вычислении, нг/мм³;

V₁ – объем растворенного остатка, мм³ (V₁=100 мм³)

V₂ – объем очищенной анализируемой пробы, сопоставимый с объемом рабочего стандартного раствора А или В и используемый в вычислении, мм³;

m₁ – объем или масса пробы, см³ или г.

Лабораторная работа № 4