Буферные свойства белковых молекул
Буферные системы обеспечивают относительное постоянство значений рН внутренней среды организма.
Большую роль в стабилизации значений рН биологических жидкостей играют молекулы белков, обладающие амфотерными свойствами. Вклад небикарбонатной системы крови, представленной в основном гемоглобином, в общую буферную емкость крови составляет около 35%.
Исследование буферных свойств белковых растворов — один из эффективных методов выявления конформационных изменений макромолекул белка при воздействии различных физико-химических факторов.
Любая буферная система состоит из слабой кислоты (донор протонов) и сопряженного с ней основания (акцептор протонов). Диапазон значений рН, на котором происходит лишь небольшое изменение величины рН, представляет собой буферную область кислотно-основной пары. Для каждой сопряженной кислотно-основной пары характерна своя область рН, в которой она может служить эффективной буферной системой. В средней точке буферной области, где концентрация донора протона равна концентрации сопряженного основания, буферная емкость системы максимальна.
Для высших организмов важную роль играют буферные свойства крови, кислотность которой варьирует в узком интервале рН (7,35-7,45). Единственной аминокислотой, имеющей R-группу с рК близкой к этой области рН, является гистидин. Высокое содержание гистидина в гемоглобине позволяет этому белку выполнять функцию внутриклеточной регуляции рН в эритроцитах. Способность ионогенных групп к обратимой диссоциации ионов Н+ в зависимости от величины рН микроокружения обусловливает формирование поверхностного заряда белковых молекул.
Сворачивание полипептида в глобулу приводит к тому, что часть ионогенных групп оказывается «спрятанными» от водного окружения. Поэтому кислотная или щелочная буферные емкости раствора определяются не только количеством ионогенных групп в полипептидной цепочке, но и их доступностью для титрования, определяемой конформационным состоянием молекулы. Так, изоэлектрическая точка оксигемоглобина (6,6) смещена в слабокислую область рН в отличие от таковой гемоглобина (6,8) вследствие повышения экспозиции кислых аминокислотных остатков (Asp, Glu) при взаимодействии гемопротеида с кислородом.
Ионогенные группы белка
При изучении буферных свойств растворов белка получают важную информацию о структуре макромолекул. Для этого используют метод кислотно-основного титрования, который позволяет определить:
- число и тип диссоциирующих групп, их кажущиеся рК;
- тип взаимодействия ионогенных групп белка с лигандом;
- состояние групп, участвующих в формировании пространственной структуры биополимера;
- величину поверхностного заряда молекулы;
- наличие или отсутствие рН-зависимых конформационных состояний белковой молекулы;
- доступность для титранта функциональных групп аминокислотных остатков белка и др.
Перечень ионогенных групп аминокислот и соответствующие им значения рК приведены в табл. 2. При этом нужно учитывать, что значения рК этих групп могут несколько отличаться от приведенных в таблице вследствие их взаимодействия друг с другом.
Расчет числа связанных с аминокислотными остатками ионов Н+ для водорастворимых белков проводят по измеренным значениям рН, допуская, что изоионная молекула не влияет на ионную силу раствора, и коэффициент активности водородного иона является постоянной величиной.
Количество ассоциированных с аминокислотными остатками протонов определяется разностью между общим числом добавленных Н+-ионов (НС1) и числом свободных ионов водорода в растворе, которое оценивается потенциометрическим методом. При закислении раствора до значений рН=1,5 протонируется максимальное число ионогенных групп белка.
Таблица 2 - Ионогенные группы белка
| Группа | рК | Аминокислота |
| α-карбоксильная | 3,50 | С-концевая |
| β-карбоксильная | 3,86 | Asp |
| γ-карбоксильная | 3,86 | Glu |
| имидазольная | 6,04 | His |
| α-аминная | 8,03 | N-концевая |
| сульфгидрильная | 8,33 | Cys |
| фенольная | 10,07 | Туг |
| ε-аминная | 10,53 | Lys |
| гуанидиновая | 12,48 | Arg |
Из кислых реагентов для титрования белков обычно применяют соляную кислоту, а при титровании щелочью применяют гидроксид калия, диссоциация которых не вызывает значимых изменений в электролитном составе среды. Ионную силу раствора в процессе титрования поддерживают строго на заданном уровне, определяющем конформационное состояние белка.
Результаты измерений буферной емкости исследуемого раствора представляют в виде графиков зависимости изменения величины рН от количества прилитого титранта — кривых кислотно-основного титрования (КОТ) (рис. 3 на странице 14).
Т.Кеннан предложил разделять кривую титрования на следующие участки:
1. рН=1,5-5-6,0 (диссоциация карбоксильных групп);
2. рН=6,0-5-8,5 (диссоциация NН+-группы имидазольного кольца гистидина и концевых α-аминогрупп);
3. рН=8,5-5-11,5 (диссоциация сульфгидрильных групп цистеина, фенольных групп тирозина и ε-аминогрупп лизина); аргинин при титровании не определяется.
Титрование белковых растворов обычно проводят после их предварительного закисления до рН=1,5 или защелачивания до рН=11,5. В первом случае измеряют щелочную, а во втором — кислотную буферную емкость белка. Для этого, например, кислый раствор белка титруют щелочью (КОН) в интервале рН=1,5-11,5. С учетом полученных результатов титрования оценивают количество диссоциированных кислых (рН=1,5-7,0) и основных (рН=7,0-11,5) аминокислотных остатков в составе молекулы белка.
Количество ионогенных групп, определяемых экспериментально, обычно ниже числа ионизируемых аминокислотных остатков, входящих в состав белка, вследствие неодинаковой их доступности для титранта, обусловленной пространственной структурой макромолекулы. Максимальное приближение к теоретическим значениям буферной емкости достигается при денатурации белковой глобулы.
Расчет величин буферной емкости растворов белка в широком диапазоне рН (1,5-5-11,5) проводят с использованием интегральной кривой КОТ или выявляют характер распределения величин буферной емкости на отдельных участках этой кривой. В этом случае дифференциальная форма кривой (спектр буферной емкости) позволяет более детально анализировать структурные свойства белковой молекулы. Формируемые на кривой спектра буферной емкости пики соответствуют величинам рК различных ионогенных групп, к которым применим метод анализа спектральных кривых.