Макромолекулярные белковые комплексы

Полифункциональные макромолекулярные комплексы образуются в результате ассоциации функционально разных белков, каждый из которых обладает всеми четырьмя уровнями структурной организации. Такое компактное расположение белков позволяет им более эффективно выполнять свои функции. Макромолекулярные комплексы функционируют в системе транспорта электронов, участвуют в биосинтезе жирных кислот, метаболизме пирувата и других синтетических и катаболических путях.

Физико-химические свойства белков

Белки представляют собой макромолекулы, содержащие большое количество кислых и оснóвных функциональных групп. Кислые свойства белка определяются, главным образом, присутствием карбоксильных групп дикарбоновых аминокислот, а также фенольных, гидроксильных и сульфгидрильных групп. Аминные, гуанидиновые, имидазольные и амидные-группы аминокислот придают белкам оснóвные свойства. На кислотно-щелочные свойства белка, в целом, влияет также характер соединения остатков аминокислот в белковой молекуле. Обладая одновременно кислотными и оснóвными свойствами, белки образуют биполярные ионы. Важнейшим фактором, определяющим поведение белка как аниона или катиона, является концентрация водородных ионов. Снижение рН среды уменьшает кислотную диссоциацию белка и переводит его в катион и, наоборот, повышение рН понижает щелочную диссоциацию и переводит белковые частицы в анионы.

При определенном значении рН (неодинаковом для различных белков) кислотная и щелочная диссоциации уравниваются, в результате суммарный заряд белка в целом может стать равным практически нулю. В этих условиях молекула белка находится в изоэлектрическом состоянии и утрачивает способность перемещаться в электрическом поле. Значение рН раствора, при котором молекула белка находится в изоэлектрическом состоянии, называется изоэлектрической точкой белка. При значении рН раствора, соответствующем изоэлектрической точке, белок существует в виде амфотерного иона, несущего суммарные одинаковые по величине как положительный, так и отрицательный заряд. Для большинства белков изоэлектрическая точка близка к нейтральному значению рН среды, но несколько сдвинута в кислую сторону. Это объясняется тем, что кислотные свойства белков преобладают над щелочными и в растворе с нейтральным рН они реагируют как слабые кислоты. Молекулы таких белков содержат больше дикарбоновых аминокислот, чем положительно заряженных. Некоторые белки, наоборот, относительно богаче оснóвными аминокислотами, поэтому при нейтральном рН они ведут себя как слабые основания. Такие белки (например, гистоны и протамины) имеют изоэлектрическую точку в слабощелочном растворе.

Изоэлектрическая точка зависит от ионной силы и вида используемого буфера, так как компоненты буферного раствора оказывают существенное влияние на степень ионизации ионогенных групп боковых радикалов аминокислот:

белок-катион ↔ белок-цвиттерион ↔ белок-анион

Растворы белков в изоэлектрической точке наименее устойчивы. В этом случае сила отталкивания одноименно заряженных групп, повышающая устойчивость белкового раствора, уменьшается, и в качестве основного фактора стабилизирующего раствор белка выступает лишь гидратная оболочка биополимера. При этом возрастает спонтанная преципитация белковых молекул, понижающая его растворимость. В таких условиях белки, обладающие гидрофобными свойствами (например, казеин), то есть не имеющие водной оболочки, выпадают в осадок даже без дополнительных воздействий.

Растворимость белков

Растворимость белков в воде зависит от всех перечисленных выше свойств белков: формы, молекулярной массы, величины заряда, соотношения полярных и неполярных функциональных групп на поверхности белка. Кроме этого, растворимость белка определяется составом растворителя, то есть наличием в растворе других растворенных веществ. Например, некоторые белки легче растворяются в слабом солевом растворе, чем в дистиллированной воде. С другой стороны, увеличение концентрации нейтральных солей может способствовать выпадению определённых белков в осадок. Денатурирующие агенты, присутствующие в растворе, также снижают растворимость белков.

Явление денатурации

Денатурацией называют существенное изменение третичной и вторичной структуры белка, связанное с нарушением, разупорядочиванием нековалентных взаимодействий без разрушения ковалентных связей. Данный процесс наблюдается при воздействии различных физических (нагревание) и химических (кислоты, ионы тяжелых металлов, спирты и так далее) факторов на растворы белков. При этом белки часто переходят в нерастворимое состояние вследствие агрегации молекул. В ряде случаев такие изменения являются обратимыми, и при прекращении воздействия молекулы белка возвращаются в свое исходное состояние. При этом растворимость белков восстанавливается. Такой процесс носит название ренатурации белка.

Тепловая денатурация

Почти все белки денатурируют при нагревании (исключением является, например, желатин). Этот процесс носит необратимый характер. Температура денатурации для разных белков различна. Присутствие солей и концентрация водородных ионов играют важную роль в тепловой денатурации белков. Наиболее быстрая коагуляция наблюдается в изоэлектрической точке (для большинства белков это слабокислый раствор). В нейтральных и сильнокислых растворах осаждение таких белков происходит значительно хуже, а при высоком значении рН вовсе не наблюдается (исключение – оснóвные белки). Добавление к раствору белка нейтральных солей облегчает и ускоряет коагуляцию белков при нагревании вследствие дегидратирования белковых молекул.

Теоретическая часть

Сложные белки

Сложные белки состоят из полипептидных цепей, построенных из аминокислот, а также включают компоненты не аминокислотной природы, представленные кофакторами и простетическими группами. В зависимости от химической природы простетической группы сложные белки делят на несколько классов:

Хромопротеидыпредставляют собой сложные белки, состоящие из белковой части и связанного с ней окрашенного небелкового компонента – простетической группы. Различают железопорфирины или гемопротеиды (содержат в качестве простетической группы гем), магнийпорфирины и флавопротеиды. Хромопротеиды участвуют в таких процессах жизнедеятельности, как транспорт кислорода и углекислого газа, клеточное дыхание, окислительно-восстановительные реакции, фотосинтез, свето- и цветовосприятие.

Гликопротеиды – это сложные белки, простетическая группа которых представлена углеводами. Углевод соединяется с белковой частью ковалентными связями. В присоединении углеводного фрагмента принимают участие OH-группы остатков серина или треонина. Этим белкам принадлежит важная роль в структурной организации клеток и тканей, они также выполняют защитные функции (к гликопротеидам относятся иммуноглобулины).

Липопротеины. Простетической группой липопротеинов являются липиды. Такие липид-белковые комплексы обеспечивают транспорт липидов в крови, липопротеины являются компонентами биологических мембран. В образовании липопротеинов принимают участие гидрофобные или ионные взаимодействия, возникающие между белковой частью молекулы липопротеина и липидом.

Металлопротеиды. В данных белках простетическая группа представлена металлом. Эти сложные белки транспортируют или участвуют в депонировании соответствующих ионов металлов. В составе металлопротеидов простетическая группа образует с аминокислотными радикалами белка координационные связи. К наиболее известным представителям металлопротеидов относятся: а) ферритин, содержащий до 20% трехвалентного железа, выполняет функцию депо железа в организме. Железо связано прочной связью с азотом белковой части. Основное количество ферритина содержится в печени и селезенке. Некоторая часть этого белка находится в плазме крови; б) трансферрин, содержит около 0,13% железа и выполняет роль переносчика железа, которое в молекуле белка непрочно связано с ОН-группой тирозина. Каждая молекула трансферрина связывает два иона двухвалентного железа. К металлопротеидам относят также ряд ферментов, в которых атом металла входит в состав активного центра и непосредственно участвует в выполнении катализа. Примерами таких металлопротеидов являются цинк содержащая карбоксипептидаза А, медь содержащая цитохромоксидаза, использующая для катализа селен глутатионпероксидаза, митохондриальная форма супероксиддисмутазы включающая ион марганца, цитозольная форма этого фермента включающая медь или цинк.

Фосфопротеиды. Простетической группой этих сложных белков является остаток ортофосфорной кислоты. Примерами ферментов, содержащих в активном центре остаток ортофосфорной кислоты, который принимает непосредственное участие в катализе являются фосфоглюкомутаза, обеспечивающая образование глюкозо-6-фосфата из глюкозо-1-фосфата, фосфоглицеромутаза превращающая 3-фосфоглицерат в 2-фосфоглицерат и дифосфоглицеромутаза обеспечивающая образование 2,3-дифосфоглицерата из 1,3-фосфоглицерата и 3-фосфоглицерата.

Присоединение или отщепление остатков фосфорной кислоты характерно для процессов фосфорилирования и дефосфорилирования белков, которые играют важную роль в системах регуляции метаболических путей. Этот механизм позволяет контролировать активность ряда жизненно важных ферментов. Примером может служить первый фермент, участвующий в мобилизации гликогена – гликогенфосфорилаза, которая обеспечивает фосфоролиз данного полисахарида в печени. Фосфорилирование одного из остатков серина обеспечивает активацию этого фермента, при отщеплении фосфатной группы происходит его инактивация. Во многих случаях цикл фосфорилирования/дефосфорилирования белков зависит от функции аденилатциклазной системы. Любое воздействие сАМР на такие процессы, как стероидогенез, секреция, транспорт ионов, метаболизм углеводов и жиров, индукция ферментов, регуляция транскрипции генов, рост и деление клеток регулируются активностью специфических протеинкиназ или специфических протеинфосфатаз, либо доступностью субстратов для фосфорилирования. Многие белки, в том числе казеин, гистоны и протамины могут также подвергаться фосфорилированию.

Нуклеопротеиды. Простетическая группа у таких белков – нуклеиновая кислота. Различают дезоксирибонуклеопротеины (простетическая группа – ДНК) и рибонуклеопротеины (простетичесая группа – РНК). Им принадлежит важная роль в хранении, передаче и реализации генетической информации. Между белком и молекулой нуклеиновой кислоты образуются ионные связи.

Гемопротеиды

Гемсодержащие белки участвуют в процессах транспорта электронов, транспорта кислорода, фотосинтеза. Классическими представителями сложных белков этой группы являются миоглобин и гемоглобин. На примере этих гемопротеидов можно четко проследить связь между структурой и функцией глобулярных белков. Данные гемопротеиды содержат в качестве простетической группы гем – циклический тетрапиррол, включающий атом железа, присутствие которого объясняет красный цвет данных белков и их способность запасать кислород (миоглобин) или обеспечивать его транспорт (гемоглобин). Тетрапирролы состоят из четырех молекул пиррола (Рис. 3.1), связанных между собой четырьмя a-метиновыми мостиками, что обеспечивает образование плоской (планарной) кольцевой структуры, несущей в определенных положениях соответствующие заместители.

Рисунок 3.1 – Структурная формула пиррола.

В тетрапиррольных структурах могут присутствовать разные b-заместители представленные метильными (М), винильными (V) и пропионатными (Pr) группами. Например, в составе гема указанные заместители расположены в следующем порядке: M, V, M, V, M, Pr, Pr, M (Рис. 3.2).

Рисунок 3.2 – Структура гема.

В центре плоского тетрапиррольного кольца находится один атом железа в ферро-(Fe²⁺)-состоянии. Похожие по строению простетические группы, содержащие ионы металлов, обнаруживают и в других белках: цитохромах, хлорофилл-содержащих белках (Mg²⁺) и некоторых ферментах, например, каталазе, триптофанпирролазе и других. В цитохромах происходит циклическое окисление и восстановление атома железа (Fe²⁺ ↔ Fe³⁺), играющее определяющую роль в их функционировании. Напротив, окисление Fe²⁺ до Fe³⁺ в миоглобине или гемоглобине сопровождается потерей их биологической активности.

Миоглобин

Миоглобин, содержащийся в клетках скелетных мышц, запасает кислород в связанном состоянии и способствует его передаче в митохондрии, которые в процессе окисления поступающих в клетку питательных веществ кислород потребляют и генерируют АТР необходимый для мышечного сокращения. Миоглобин в пять раз быстрее, чем гемоглобин связывает кислород (другими словами имеет более высокое сродство к кислороду, чем гемоглобин).

Миоглобин состоит из единичной полипептидной цепи, состоящей из 153 аминокислотных остатков и одной гемо-группы (Рис. 3.3). В результате проведенного рентгеноструктурного анализа было сделано несколько важных выводов относительно организации молекулы этого гемопротеида:

1. 75% полипептидной цепи находится в конформации a-спирали (все a-спирализованные участки являются правозакрученными). Обнаружено 8 основных участков спирализации, которые обозначены первыми буквами латинского алфавита: А, B, C, D, E, F, G и H. Спирализованные участки разделены 5 неспирализованными участками; такие же неспирализован-ные области находятся на концах цепи.

2. Молекула миоглобина настолько компактна, что внутри нее может уместиться всего четыре молекулы воды.

3. Все полярные радикалы, за исключением двух (два остатка гистидина принимают участие в связывании кислорода), расположены на внешней поверхности молекулы.

4. Большая часть гидрофобных радикалов расположена внутри молекулы миоглобина и таким образом защищены от соприкосновения с водой.

5. Каждый из четырех остатков пролина в молекуле миоглобина находится в месте изгиба полипептидной цепи. В других местах изгиба или поворотацепи расположены остатки серина, треонина и аспарагина.

Рисунок 3.3 – Пространственная модель миоглобина кашалота (PDB ID 1MBO).

Гемоглобин

Гемоглобины – это структурно-родственные белки эритроцитов позвоночных, выполняющие две важные биологические функции: 1) перенос О₂ из легких к периферическим тканям; 2) перенос СО₂ и протонов от периферических тканей к дыхательным органам для последующего выделения из организма. Гемоглобины представляют собой тетрамерные белки, молекулы которых образованы попарно ассоциированными разными типами полипептидных цепей, которые обозначаются буквами a, b, g, d, S и др. В состав тетрамерной молекулы входят по две цепи двух разных типов. Гемоглобин взрослого человека, обозначаемый А₁, состоит из двух a- и двух b-цепей. Их длина примерно одинакова – a-цепь содержит 141 остаток, а b-цепь – 146. В молекуле гемоглобина гем расположен в щели между двумя a-спирализованными участками каждой цепи (Рис. 3.4).

Рисунок 3.4 – Структура гемоглобина человека.

Пропионатные группы гема ориентированы к поверхности глобулы, а другие заместители обращены внутрь глобулы и окружены неполярными (гидрофобными) аминокислотными остатками. Исключение составляют два остатка гистидина – проксимальный и дистальный, которые расположены вблизи атома железа. Причем, атом азота гетероциклического кольца проксимального гистидина связан пятой координационной связью с атомом железа (четыре другие связи атом железа образует с азотами пиррольных колец гема). В норме дистальный гистидин не взаимодействует с атомом железа, который предназначен для связывания молекулы кислорода.

Свойства индивидуальных гемоглобинов определяются их олигомерной организацией. Наиболее изученными гемоглобинами являются:

гемоглобин взрослого человека – HbA₁, имеющий структуру a₂b₂. В эритроцитах здорового взрослого человека гемоглобин А₁ является основным вариантом гемоглобина и составляет в норме почти 97% общего гемоглобина эритроцитов. На долю минорного гемоглобин взрослого человека HbA₂, представленного тетрамером a₂d₂, приходится около 3%.

Фетальный гемоглобин HbF, состоящий из цепей a₂g₂ присутствует и в крови взрослого человека, но в норме его содержание не превышает 1% от общего количества гемоглобина крови взрослого и определяется в 1-7% от общего числа эритроцитов крови. Однако у плода эта форма гемоглобина является доминирующей.

Серповидноклеточный гемоглобин HbS относится к мутантным гемоглобинам. Этот особый мутантный вариант гемоглобина, образующийся у больных с серповидно-клеточной анемией, в отличие от нормальной формы гемопротеида растворенной в цитоплазме эритроцита склонен к кристаллизации в красных кровяных клетках in vivo. В гемоглобине S по сравнению с нормальным гемоглобином Α в b-цепях имеется единичная аминокислотная замена: в 6-й позиции нормальной b-цепи глобина L-глутаминовая кислота замещена на L-валин. Поскольку валин имеет неполярный радикал, располагающийся на поверхности молекулы, в результате этой замены растворимость гемоглобина резко падает. Общая формула тетрамеров гемоглобина S записывается как a₂S₂.

Четвертичная (олигомерная) структура наделяет гемоглобин важными особенностями, которые способствуют выполнению его уникальной биологической функции и обеспечивают возможность строгой регуляции его свойств.

Выделяют пять форм гемоглобина: 1) оксигемоглобин; 2) дезокси-гемоглобин 3) карбоксигемоглобин; 4) карбгемоглобин; 5) метгемоглобин.

Оксигемоглобин (oxyhemoglobin) – форма гемоглобина, образующаяся в результате его оксигенации, то есть присоединения к каждому гему молекулы кислорода. Такая способность обусловлена присутствием двухвалентного иона железа в геме. Образование оксигемоглобина сопровождается конформационной перестройкой молекулы гемоглобина.

Карбоксигемоглобин (carboxyhemoglobin) – трудно диссоциирующее соединение гемоглобина и угарного газа. Переизбыток в крови карбоксигемоглобина приводит к кислородному голоданию, так как угарный газ, прочно связанный с гемоглобином, лишает его возможности присоединять к себе кислород.

Карбгемоглобин (carbhemoglobin) – соединение гемоглобина с углекислым газом (СО₂), участвует в обмене СО₂ в организме животных и человека. Гемоглобин не только переносит кислород от легких к периферическим тканям, но и ускоряет транспорт СО₂ от тканей к легким. Данный гемопротеид связывает СО₂ сразу же после высвобождения кислорода, при этом примерно 15% СО₂, присутствующего в крови, переносится молекулами гемоглобина. Этот процесс зависит от присутствующей в эритроцитах карбоангидразы, которая катализирует превращение поступающего из тканей СО₂ в угольную кислоту. Последняя быстро и спонтанно диссоциирует на бикарбонат-ион и протон.

Для предотвращения опасного понижения рН в крови должна существовать буферная система, способная поглощать избыток протонов. Эту функцию также выполняет гемоглобин, который связывает два протона на каждые четыре освободившиеся молекулы кислорода и, тем самым, определяет буферную емкость крови.

В легких идет обратный процесс: присоединение кислорода к дезоксигемоглобину сопровождается высвобождением протонов, которые связываются с бикарбонат-ионами с образованием угольной кислоты. Эффективно действующая карбоангидраза катализирует превращение угольной кислоты в углекислый газ, выдыхаемый из легких.

Окисление ферро-(Fe²⁺)-формы железа гема в ферри-(Fe³⁺)-форму приводит к образованию метгемоглобина – функционально неактивной формы гемоглобина, лишенной возможности связывать кислород. Обычно в эритроцитах накапливается до 1% метгемоглобина в сутки, что связанно с обычным процессом автоокисления оксигемоглобина. Восстановление гемового железа до ферро-(Fe²⁺)-формы осуществляется NADH-метгемоглобинредуктазой, которая ответственна за поддержание низкого уровня физиологически неактивной формы гемоглобина в красных кровяных клетках. Вторым продуктом автоокисления гемоглобина являются высокоактивные супероксидные анионы – О₂^·¯, которые служат субстратом для супероксиддисмутазы, обеспечивающей прерывание цепи генерирования свободных радикалов в эритроцитах.

Цитохромы

Цитохромы – сложные железосодержащие белки, относящиеся к гемопротеидам, простетическая группа которых представлена гемом. Цитохромы широко распространены в растительных и животных клетках и микроорганизмах (дрожжах, аэробах и некоторых факультативных анаэробах) и связаны с мембранами митохондрий, эндоплазматического ретикулума, хлоропластов и хроматофоров. Они играют важную роль во многих процессах, протекающих в живых организмах, – клеточном дыхании, фотосинтезе, микросомальном окислении. Все цитохромы способны отдавать и принимать электрон путём обратимого изменения валентности атомов железа, входящих в состав гема. Объединённые в короткие или длинные цепи (в зависимости от величины потенциала конечного акцептора электронов) цитохромы переносят электроны от дегидрогеназ к конечным акцепторам. Передача электронов от цитохрома к цитохрому позволяет клетке использовать энергию химических соединений или солнечного света в энергетических или пластических целях. Так, в составе цепи дыхательных ферментов митохондрий цитохромы при участии цитохромоксидазы осуществляют конечные этапы окисления субстратов кислородом. Освобождающаяся при этом энергия утилизируется для образования АТР или в виде мембранного потенциала. Цитохромы эндоплазматического ретикулума являются частью системы, осуществляющей обмен и обезвреживание ароматических соединений-ксенобиотиков.

По спектральным характеристикам, химическому строению боковых цепей гема и природе связи гема с белковой частью этих гемопротеидов цитохромы подразделяют на 4 типа: а, b, с, dВ восстановленном состоянии абсолютные спектры цитохромов имеют три выраженные полосы поглощения, характерные для каждого типа цитохромов и позволяющие определять их содержание методом спектрофотомерии. Получение высокоочищенных цитохромов затруднено тем, что они прочно связаны с мембранами и отделяются только при обработке поверхностно-активными веществами или протеолитическими ферментами. Исключение составляют цитохромы b₃ и с (Рис. 3.5), легко экстрагируемые из мембран солевыми растворами.

Рисунок 3.5 – Структура цитохрома с.

Теоретическая часть

Ферменты

Живые системы состоят из достаточно ограниченного набора химических элементов, на долю которых (C, H, O, N, P, S) приходится более 99% общей массы клеток. Поскольку химический состав клеток, существенно отличается от химического состава земной коры, это означает, что биологические системы способны осуществлять химические реакции особого рода.

Если не принимать во внимание воду, почти все молекулы клетки относятся к соединениям углерода. Среди химических элементов Земли именно углерод занимает особое место по способности образовывать множество малых и больших молекул (макромолекул). Из-за малого размера атома и наличия на внешней оболочке четырех электронов атомы углерода могут образовывать прочные ковалентные связи с другими атомами, а также друг с другом, что приводит к формированию колец или длинных цепей и, как следствие, созданию больших и сложных молекул.

Одно из часто встречающихся определений биологических систем сводится к тому, что живые организмы представляют собой автономные самовоспроизводящиеся химические системы, построенные из специфического и вместе с тем достаточно ограниченного набора углеродсодержащих малых молекул и макромолекул.

Итак, основу жизнедеятельности любого организма составляют химические процессы особого рода. Практически все реакции в живой клетке протекают с участием высокоэффективных природных биокатализаторов, называемых ферментами, или энзимами. Рассматривая клеточные метаболические пути, может показаться, что клетка обладает возможностью осуществлять любую необходимую ей реакцию, используя для этой цели соответствующий фермент. В действительности это не так. Хотя ферменты и являются мощными катализаторами, они могут ускорять только те реакции, которые «разрешены» с точки зрения термодинамики. Среди множества энергетически возможных реакций ферменты избирательно преобразуют соответствующие «реагенты», называемые субстратами, по физиологически полезному пути. Таким образом, ферменты управляют всеми метаболическими процессами организма.

До недавнего времени считалось, что абсолютно все биокатализаторы являются веществами белковой природы. Однако в 80-е годы ХХ столетия были обнаружены специфические низкомолекулярные РНК, обладающие каталитической активностью. Эти каталитические РНК по аналогии получили название рибозимов. Остальные известные на данный момент биокатализаторы клетки, число которых превышает 2500, имеют белковую природу и характеризуются всеми свойствами белков. К настоящему времени расшифрованы аминокислотные последовательности сотен различных ферментов, многие получены в кристаллическом виде, по данным рентгеноструктурного анализа установлена трех­мерная пространственная структура и описаны механизмы их действия и изучается их роль в клеточных метаболических превращениях.

Подобно неорганическим катализаторам, ферменты не расходуются в процессе реакции, увеличивают скорость как прямой, так и обратной реакции, не изменяют положения равновесия. Однако белковая природа ферментов обусловливает появление у них ряда свойств, в целом нехарактерных для неорганических катализаторов.

Основные отличия ферментов от неорганических катализаторов сводятся к следующим особенностям:

1. Ферменты имеют более высокую каталитическую активность (в миллионы раз превышающую действие неорганических катализаторов). Например, гидролиз белка в присутствии неорганических кислот и щелочей протекает при 100°С в течение нескольких десятков часов. При участии ферментов этот процесс сокращается до десятков минут при 30–40°С;

2. Каталитическая активность ферментов проявляется в очень мягких условиях (умеренные температуры 37–40°С, нормальное давление, близкие к нейтральным значения рН среды 6,0–8,0);

3. Ферменты обладают высокой специфичностью действия, т.е. каждый фермент катализирует в основном только строго определенную химическую реакцию (для сравнения, платина в органическом синтезе катализирует несколько десятков химических превращений);

4. Скорость ферментативных реакций подчиняется определенным кинетическим закономерностям;

5. Ряд ферментов при формировании третичной и четвертичной структуры подвергаются пост-трансляционной модификации;

6. Размеры молекулы ферментов обычно намного превышают размеры их субстратов;

7. Активность ферментов в клетках строго контролируется и регулируется.