Клонирование структурных генов эукариот..... 70
Векторы для клонирования крупных фраг-
ментов ДНК..................................................................... 71
Векторы на основе бактериофага λ................... 71
Космиды...................................................................... 74
Векторные системы для клонирования
очень крупных фрагментов ДНК................. 76
Генетическая трансформация прокариот.......... 76
Перенос ДНК в E. coli.............................. 76
Электропорация........................................ 76
Конъюгация.............................................. 77
Заключение.................................................. 77
Литература................................................... 78
Контрольные вопросы................................. 79
Глава 5. Химический синтез, определение
11>клеотцлной последовательности и ампли-
фикация ДНК................................................................. 80
Химический синтез ДНК............................. 80
Фосфорамидитный метод........................ 80
Применение синтезированных олиго-
нуклеотидов............................................................... 85
Синтез генов.............................................. 86
Методы секвенирования ДНК..................... 88
ДидезоксинуклеотидныЙ метод секве-
пиронания ДНК.......................................... 89
Секвснирование ДНК с помощью вектора
па основе фага М13.................................................. 91
Прий мер-опосредованная прогулка.................. 93
Полимеразная цепная реакция............................... 94
Получение с помошью ПЦР кДНК, от-
вечающих концам молекул мРНК........... 98
Синтез генов с помошью ПЦР............... 102
Заключение................................................................... 102
Литература.................................................................... 103
Контрольныевопросы................................. 104
Глава 6. Оптимизация экспрессии генов,
Клонированных в прокариитических
системах.......................................................................... 105
Экспрессия генов при участии сильных
регулируемых промоторов........................ 105
Оглавление 5S5
Регулируемые промоторы.......................... 107
Получение больших количеств белковых
продуктов................................................. 108
Крупномасштабные системы..................... 109
Использование для экспрессии других
микроорганизмов...................................... 111
Химерные белки........................................... 112
Расщепление химерных белков................. 112
Применение химерных белков.................. 113
Включение белков в поверхностные струк-
туры ......................................................... 115
Однонаправленное тандемное
расположение генов...................................... 117
Трансляционные экспрессирующие век-
торы............................................................. 118
Стабилизация белков.................................... 121
Рост в условиях недостатка кислорода.......... 122
Применение хозяйских штаммов с дефи-
цитом протеиназ......... ,............................ 122
Бактериальный «гемоглобин»................... 122
Инте1риция чужеродной ДНК в хромосо-
му хозяина................................................... 123
Повышение эффективности секреции........... 126
Метаболическая перегрузка........................... 127
Заключение................................................... 130
Литература.................................................... 131
Контрольные вопросы................................... 133
Глава 7. Получение рекомбиыантных белков
с помощью эукариотических систем.................. 135
Системы экспрессии Saccharomyces сеге-
visiae................................................................................. 136
Векторыдля S. cerevisiae......................... ,...137
Прямая экспрессия в S. cerevisiae............... 137
Секреция гетерологичных белков, синте-
зируемых S. cerevisiae................................ 139
Другие дрожжевые системы экспрессии........ 140
Синтез поверхностного антигена вируса
гепатита В................................................. 141
Синтез бычьего лизоцима С2..................... 142
Системы экспрессии с использованием
культур клеток насекомых............................. 143
Система экспрессируюших векторов на
основе бакуловирусов............................... 144
Получение рекомбинантных бакулови-
русов........................................................ 145
Создание челночного вектора на основе
бакуловирусов для E. coli и клеток на-
секомых ....................................................... 146
Выделение рекомбинантного белка из кле-
ток насекомых с помощью аффинного
связывания.. ...149
Экспрессирующие векторы для работы с
клетками млекопитающих............................ 149
Селективные маркерные гены................... 150
Экспрессия двух клонированных генов
в одной клетке млекопитающих................ 151
Заключение.................................................. 154
Литература................................................... 155
Контрольные вопросы.................................. 156
Глава 8. Направленный мутагенез и генная
инженерия белков........................................ 158
Направленный мутагенез: методика.............. 158
Олигонуклеотид-направленныЙ мутагенез
с использованием ДНК фага М13.............. 159
Олигонуклеотид-направленныЙ мутагенез
с использованием плазмидной ДНК.......... 161
Олигонуклеотид-направленныЙ мутагенез
с использованием ПЦР-амплификации...... 163
Случайный мутагенез с использованием
«вырожденных» олигонуклеотидных i iptm-
меров........................................................ 163
Случайный мутагенез с использованием
аналогов нуклеотидов............................... 166
Генная инженерия белков............................. 168
Образование дополнительных дисульфид-
ных связей.................................. ,............ 168
Замена аспарагина на другие аминокис-
лоты......................................................... 170
Уменьшение числа свободных сульфгид-
рильных групп.......................................... 170
Повышение ферментативной активности.. 171
Измене!гие ιюгребности ферментов в ме-
таллических кофакторах............................ 172
Изменение специфичности фермента........ 173
Повышение стабильности и специфич-
ности фермента......................................... 174
Заключение.................................................. 175
Литература................................................... 175
Контрольные вопросы.................................. 176
МАСТЬ II
МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОТЕХНОЛОГИЯ
МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИХ СИСТЕМ..... 179
Глава 9. Молекулярная диагностика................. 181
Методы иммунодиагностики........................ 182
Ферментный иммуносорбентныи анализ... 182
Моноклональные антитела........................ 184
Образование и отбор гибридных клеток ,...1Й5
Идентификация гибридных клеточных ли-
ний, секретирующих специфические ан-
титела.. 185
Оглавление
Системы ДНК-диагностики................................. 187
Гибридизационные зонды................................ 188
Диагностика малярии...................................... 188
Выявление Trypanosoma cruzi.......................... 189
Нерадиоактивные методы детекции.................... 190
Геномная дактилоскопия................................. 192
Использование полиморфных ДНК-маркеров ....194
Молекулярная диагностика генетических
заболеваний..................................................... 195
Серповидноклеточная анемия........................... 195
Метод ПЦР/ЛОЗ........................................... 196
Генотипирование с использованием флуо-
ресцентно меченных ПЦР-праймеров.................. 198
Мутации в разных сайтах одного гена................. 199
Перспективы.................................................... 201
Заключение..................................................... 201
Литература...................................................... 202
Контрольные вопросы........................................ 203
Глава 10. Микробиологаческое производство
лекарственных средств.................................. 204
Лекарственные препараты............................. 204
Выделение кДНК интерферонов........................ 204
Интерфероны человека, полученные ме-
тодом генной инженерии................................. 207
Гормон роста человека, полученный ме-
тодом генной инженерии.................................. 208
Оптимизация генной экспрессии........................ 208
Ферменты....................................................... 209
ДНКаза!..................................................... 209
Альгинат-лиаза............................................. 209
Моноклональные антитела как лекарствен-
ные средства.................................................... 210
Структура и функции антител............................ 211
Профилактика отторжения транспланти-
рованных органов.......................................... 212
Лекарственные вещества, связанные с мо-
ноклональными антителами.............................. 212
Моноклональные антитела человека................... 214
Гибридные Моноклональные антитела че-
ловека и мыши.............................................. 215
Производство антител с помощью Е. coU................ 218
Лекарственные средства против ВИЧ...................... 222
Заключение..................................................... 224
Литература...................................................... 224
Контрольные вопросы........................................ 226
Глава 11. Вакцины.................................................... 227
Субъединичные вакцины..................................... 228
Противогерпетические вакцины........................ 230
Противоящурные вакцины............................... 230
Противотуберкулезные вакцины....................... 231
Пептидные вакцины....................................... 231
Генная иммунизация...................................... 233
Аттенуированныс накщшы........................... 234
Протинохолерпые вакцины....................... 235
Противосальмонеллезные вакцины.................... 236
Противолейшманиозные вакцины...................... 237
«Векторные* вакцины........................................ 238
Протинонирусные вакцины.............................. 238
Противоб акте риал ьные вакцины..................... 242
Бактерии как системы доставки анти-
генов.......................................................... 242
Заключение...................................................... 243
Литература....................................................... 244
Контрольные вопросы........................................ 246
Глава 12. Использование рскомбинантных
микроорганизмов дляполучения коммерчес-
ких продуктов............................................................... 247
Эндонуклсазы рссчрикции................................... 247
Малые биологические молекулы................ ,......... 250
Синтез L-аскорбиновой кислоты........................ 250
Синтез индиго............................................... 252
Синтез аминокислот....................................... 255
Антибиотики.................................................... 257
Клонирование генов биосинтеза антибио-
тиков.......................................................... 259
Синтез ноных антибиотиков..................... 259
Разработка новых методов получения по-
ликетидных антибиотиков................................ 260
Усовершенствование производства анти-
биотиков...................................................... 263
Биополимеры................................................... 266
Создание рекомбинантной бактерии
Xanthomonas campestris с целью получения
ксантановой слизи „........................................ 266
Выделение генов биосинтеза меланина................ 267
Микробиологический синтез животного
биополимера с адгезивными свойствами.............. 268
Микробиологический синтез каучука.................. 270
Микробиологический синтез полигидрок-
сиалканоатов................................................ 270
Заключение...................................................... 272
Литература....................................................... 272
Контрольные вопросы................................... 274
Глава 13.Биодеградация токсичных соеди-
нений и утилизация биомассы...................... 275
Дсфадация ксенобиотиков с помощью
микроорганизмов......................................... 275
Метаболические пути биодеградации ксе-
нобиотиков, созданные методами генной
инженерии....................................................... 276
Оглавление 587
Перенос плазмид...................................... 276
Изменение генов...................................... 281
Утилизация крахмала и Сахаров................... 286
Промышленное производство фруктозы и
этанола..................................................... 287
Повышение эффективности производства
фруктозы и этанола................................... 289
Zymomonas mobilis..................................... 292
Получение силоса...................................... 294
Утилизация целлюлозы ....,........................... 294
Компоненты лигноцеллюлозы................... 294
Выделение прокариотических иеллюлаз-
ных генов................................................. 2%
Выделение эукариотических целлюлазных
генов......................................................... 298
Манипуляции с целлюлазными генами..... 300
Белок одноклеточных организмов................. 301
Заключение.................................................. 302
Литература................................................... 303
Контрольные вопросы................................... 305
Глава 14. Бактерии, стимулирующие рост
растений....................................................... 306
Фиксация азота............................................. 306
Нитрогеназа.................................................. 308
Компоненты.............................................. 308
Генная инженерия кластера генов нитро-
геназы....................................................... 310
Гидрогеназа.................................................. 313
Метаболизм водорода................................ 313
Модификация генов гидрогеназ................ 314
Образование клубеньков............................... 316
Конкуренция среди организмов, образу-
ющих клубеньки....................................... 316
Манипуляции с генами образования клу-
беньков..................................................... 316
Биоконтроль патогенных микроорганизмов.. 320
Сидсрофоры.............................................. 321
Антибиотики............................................ 322
Ферменты............... ,................................ 323
Образование кристаллов льда и антифриз-
ныс белки................................................. 325
Стимуляция роста растений свободножи-
вушими бактериями..................................... 326
Заключение.................................................. 327
Литература................................................... 328
Контрольные вопросы................................... 330
Глава 15. Микробныеинсектициды............. 331
Токсин, синтезируемый Bacillus
thuringiensis................................................... 332
Механизм действия и использование........ 332
Идентификация генов токсинов................ 335
Генная инженерия генов токсинов
В. thuringiensis.......................................... 336
Бакуловирусы как инструмент биоконт-
роля.............................................................. 342
Механизм действия................................... 342
Усиление биоконтроля с помощью генной
инженерии................................................ 343
Заключение.................................................. 344
Литература................................................... 345
Контрольные вопросы.................................. 347
Глава 16. Промышленный синтез белков при
участии рскомбинантных микроорганизмов. 349
Рост микроорганизмов................................. 350
Периодическая культура............................ 351
Периодическая культура с добавлением
субстрата.................................................. 352
Непрерывная культура.............................. 353
Повышение эффективности ферментации..... 354
Культуры с высокой плотностью............... 356
Биорсакторы................................................ 357
Типичные курпномасштабные системы
ферментации................................................ 359
Двухступенчатая ферментация в тандем-
ных эрлифтных биореакторах.................... 360
Двухступенчатая ферментация в одном ре-
акторе с механическим перемешиванием.............. 362
! 1ериодичсскам ферментация и периоди-
ческая ферментация с добавлением суб-
страта........................................................ 363
Сбор клеток.................................................. 363
Разрушение клеток....................................... 365
Дальнейшая обработка.................................. 366
Солюбилизация белков............................. 367
Заключение.................................................. 367
Литература................................................... 368
Контрольные вопросы.................................. 369
ЧАСТЬШ
ЭУКАРИОТИЧЕСКИЕ СИСТЕМЫ.................... 371
Глава 17. Геннаяинженерия растений: ме-
тодология ...................................................................... 373
Трансформация растений Tî-плазмидой
из Agrobacterium tumefaciens......................... 373
Векторные системы на основе Ti-плазмид ....377
Физические методы переноса генов в рас-
тительные клетки.......................................... 379
Бомбардировка микрочастицами................... 380
Применение репортерных генов при транс-
формации клеток растений........................... 381
iH>; Оглавление
Эксперименты по экспрессии чужеродных
генов в растениях......................................... 382
Выделение различных промоторов и их
использование.......................................... 383
Введение чужеродных генов в хлоропласт-
нуюДНК.................................................. 384
Получение трансгенных растений, не со-
держащих маркерных генов.......................... 386
Заключение.................................................. 386
Литература................................................... 387
Контрольные вопросы.................................. 388
Глава18. Генная инженерия растений: при-
менение.......................................................................... 389
Выведение растений, устойчивых к насеко-
мым-вредителям, вирусам и гербицидам....... 389
Растения, устойчивые к насекомым-
вредителям ............................................. .389
Растения, устойчиныс к вирусам............... 395
Растения, устойчивые к гербицидам..... 400
Растения, устойчивые к грибам и бакте-
риям ......................................................... 401
Получение растений, противостоящих не-
благоприятным воздействиям и старению..... 403
Окислительный стресс........................... 403
Солевой стресс.......................................... 404
Созревание плодов.................................... 405
Изменение окраски цветков......................... 406
Изменение пищевой ценности растений... 407
Аминокислоты.......................................... 408
Липиды..................................................... 408
Изменение вкуса и внешнего вида плодов.... 410
Изменение внешнего вида........................ 410
Изменение вкуса....................................... 411
Растения как биореакторы............................. 412
Антитела................................................. 412
Полимеры................................................. 412
Чужеродные белки, аккумулирующиеся
в семенах.................................................. 413
Заключение.................................................. 413
Литература................................................... 413
Контрольные вопросы................................... 416
Глава 19. Трансгенныеживотные............... 418
Трансгенные мыши; методология.................. 419
Использование рстровирусных векторов ...419
Метод микроинъскций ДНК.................. 420
Использование модифицированных эмб-
риональных стволовых клеток................... 422
Клонирование с помошью переноса
ядра.......................................................... 426
Перенос генов с помощью искусственных
дрожжевых хромосом............................ 428
Трансгенные мыши: применение.................. 430
Трансгенный крупный рогатый скот............. 433
Трансгенные овцы, козы и свиньи............. 435
Трансгенные птицы...................................... 436
Трансгенные рыбы..................................... 438
Заключение.................................................. 439
Литература................................................... 439
Контрольные вопросы................................... 441